产品简介
纤维素是由β-D-葡萄糖单元以β-1,4-糖苷键连接而成的直链多聚体，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，是植物细胞壁的主要结构成分。纤维素是一种重要的膳食纤维，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖。以纤维素为原料的产品广泛应用于食品、造纸、塑料、炸药、电工及科研器材等领域。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于分析生物样品中纤维素含量。其原理是纤维素在酸性条件下加热能分解成β-D-葡萄糖。β－葡萄糖在强酸作用下，可脱水生成β－糠醛类化合物，利用与蒽酮显色剂测定纤维素含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测620nm处的吸光度）
96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头
去离子水，浓硫酸，80％乙醇，丙酮
制冰机，离心机，水浴锅
匀浆器
试剂准备
注意：小管试剂开盖前，请先低速离心。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液的配制：临用前48T在试剂二中加入2mL试剂三；96T在试剂二中加入4mL试剂三，充分溶解，如较难溶解，可加热搅拌；用不完的试剂4℃保存一周。
标准品：含10mg无水葡萄糖，临用前加入1mL去离子水溶解得10mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或-20℃长期保存。
标准曲线设置：按下表所示用去离子水将10mg/mL标准溶液稀释为 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.00313mg/mL的标准溶液。
标准品体积 | 去离子水体积 | 浓度 | |
Std.1 | 20µL 10mg/mL | 980µL | 0.2mg/mL |
Std.2 | 400µL of Std.1 (0.2mg/mL) | 400µL | 0.1mg/mL |
Std.3 | 400µL of Std.2 (0.1mg/mL) | 400µL | 0.05mg/mL |
Std.4 | 400µL of Std.3 (0.05mg/mL) | 400µL | 0.025mg/mL |
Std.5 | 400µL of Std.4 (0.025mg/mL) | 400µL | 0.0125mg/mL |
Std.6 | 400µL of Std.5 (0.0125mg/mL) | 400µL | 0.00625mg/mL |
Std.7 | 400µL of Std.6 (0.00625mg/mL) | 400µL | 0.00313mg/mL |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
1. 细胞壁的提取：取约0.3g样本，加入1mL 80％乙醇，室温快速匀浆，90℃水浴20min（加热过程中EP管可能爆开，建议用胶带封口或使用防爆EP管），冷却至室温，6,000g 25℃离心10min，弃上清。沉淀加入1.5mL 80％乙醇和丙酮各洗一遍（涡旋振荡2min左右，6,000g 25℃离心10min，弃上清即可），沉淀即为粗细胞壁，加入1mL试剂一（去除淀粉）浸泡15小时，6,000g 25℃离心10min，弃上清，将沉淀干燥，称重得细胞壁物质（CWM）。
2. 纤维素的提取：称取烘干的CWM 约5mg，加入0.5mL去离子水充分匀浆(若烘干物质质地坚硬，可先研碎后再加入0.5mL去离子水匀浆，或者用匀浆器匀浆)，匀浆液转移至EP管中，用去离子水定容至0.5mL，置于冰水浴中，缓慢加入0.75mL浓硫酸，混匀，冰水浴中静置30min。8,000g 4℃离心10min，取上清液，用去离子水稀释20倍后待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到620nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 调节水浴锅至95度。
3. 操作表（在EP管中）：
空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） | |
样本 | 0 | 0 | 150 |
标准品溶液 | 0 | 150 | 0 |
去离子水 | 150 | 0 | 0 |
工作液 | 35 | 35 | 35 |
浓硫酸 | 315 | 315 | 315 |
混匀，置 95℃水浴中10min（盖紧，以防止水分散失），冷却至室温后，取200μL转移至96孔板或微量玻璃比色皿中，于620nm处分别读取空白管、标准管和测定管吸光值，ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。
注意：空白和标准曲线只需测定1次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定大于1.0，需要将样本用去离子水稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。由于浓硫酸具有强腐蚀性，请谨慎操作。
结果计算
1．标准曲线的绘制：
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标准为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
2．纤维素含量计算：
将ΔA测定 带入公式中（x）计算样品浓度 y（mg/mL）。
纤维素含量(mg/g干重)=(y×V样)÷(W×V样÷V样总)×20＝25×y÷W
V样：加入样本体积，0.15mL；W：样本干重，约5×10-3g；V样总：样本总体积，1.25mL；20：样本稀释倍数。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
