产品简介
纤维素是由β-D-葡萄糖单元以β-1,4-糖苷键连接而成的直链多聚体,通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起,是植物细胞壁的主要结构成分。纤维素是一种重要的膳食纤维,是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖。以纤维素为原料的产品广泛应用于食品、造纸、塑料、炸药、电工及科研器材等领域。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法,用于分析生物样品中纤维素含量。其原理是纤维素在酸性条件下加热能分解成β-D-葡萄糖。β-葡萄糖在强酸作用下,可脱水生成β-糠醛类化合物,利用与蒽酮显色剂测定纤维素含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计(能测620nm处的吸光度)
96孔板或微量玻璃比色皿,可调节式移液枪及枪头
去离子水,浓硫酸,80%乙醇,丙酮
制冰机,离心机,水浴锅
匀浆器
试剂准备
注意:小管试剂开盖前,请先低速离心。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
工作液的配制:临用前48T在试剂二中加入2mL试剂三;96T在试剂二中加入4mL试剂三,充分溶解,如较难溶解,可加热搅拌;用不完的试剂4℃保存一周。
标准品:含10mg无水葡萄糖,临用前加入1mL去离子水溶解得10mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或-20℃长期保存。
标准曲线设置:按下表所示用去离子水将10mg/mL标准溶液稀释为 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.00313mg/mL的标准溶液。
标准品体积 | 去离子水体积 | 浓度 | |
Std.1 | 20µL 10mg/mL | 980µL | 0.2mg/mL |
Std.2 | 400µL of Std.1 (0.2mg/mL) | 400µL | 0.1mg/mL |
Std.3 | 400µL of Std.2 (0.1mg/mL) | 400µL | 0.05mg/mL |
Std.4 | 400µL of Std.3 (0.05mg/mL) | 400µL | 0.025mg/mL |
Std.5 | 400µL of Std.4 (0.025mg/mL) | 400µL | 0.0125mg/mL |
Std.6 | 400µL of Std.5 (0.0125mg/mL) | 400µL | 0.00625mg/mL |
Std.7 | 400µL of Std.6 (0.00625mg/mL) | 400µL | 0.00313mg/mL |
注意:每次实验,请使用新配制的标准品。
样本制备
1. 细胞壁的提取:取约0.3g样本,加入1mL 80%乙醇,室温快速匀浆,90℃水浴20min(加热过程中EP管可能爆开,建议用胶带封口或使用防爆EP管),冷却至室温,6,000g 25℃离心10min,弃上清。沉淀加入1.5mL 80%乙醇和丙酮各洗一遍(涡旋振荡2min左右,6,000g 25℃离心10min,弃上清即可),沉淀即为粗细胞壁,加入1mL试剂一(去除淀粉)浸泡15小时,6,000g 25℃离心10min,弃上清,将沉淀干燥,称重得细胞壁物质(CWM)。
2. 纤维素的提取:称取烘干的CWM 约5mg,加入0.5mL去离子水充分匀浆(若烘干物质质地坚硬,可先研碎后再加入0.5mL去离子水匀浆,或者用匀浆器匀浆),匀浆液转移至EP管中,用去离子水定容至0.5mL,置于冰水浴中,缓慢加入0.75mL浓硫酸,混匀,冰水浴中静置30min。8,000g 4℃离心10min,取上清液,用去离子水稀释20倍后待测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存6个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到620nm,可见分光光度计去离子水调零。
2. 调节水浴锅至95度。
3. 操作表(在EP管中):
空白管(μL) | 标准管(μL) | 测定管(μL) | |
样本 | 0 | 0 | 150 |
标准品溶液 | 0 | 150 | 0 |
去离子水 | 150 | 0 | 0 |
工作液 | 35 | 35 | 35 |
浓硫酸 | 315 | 315 | 315 |
混匀,置 95℃水浴中10min(盖紧,以防止水分散失),冷却至室温后,取200μL转移至96孔板或微量玻璃比色皿中,于620nm处分别读取空白管、标准管和测定管吸光值,ΔA测定=A测定-A空白,ΔA标准=A标准-A空白。
注意:空白和标准曲线只需测定1次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定大于1.0,需要将样本用去离子水稀释,计算公式中乘以相应稀释倍数。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。由于浓硫酸具有强腐蚀性,请谨慎操作。
结果计算
1.标准曲线的绘制:
以标准溶液浓度为y轴,ΔA标准为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。
2.纤维素含量计算:
将ΔA测定 带入公式中(x)计算样品浓度 y(mg/mL)。
纤维素含量(mg/g干重)=(y×V样)÷(W×V样÷V样总)×20=25×y÷W
V样:加入样本体积,0.15mL;W:样本干重,约5×10-3g;V样总:样本总体积,1.25mL;20:样本稀释倍数。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。