产品简介
β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖水解酶（C1，EC3.2.1.91）存在于细菌、真菌和动物体内，是纤维素酶系的组份之一，也是水解天然纤维素的必需组分。C1催化多聚糖链的末端非还原端水解β-葡萄糖苷键，每次切下1个纤维二糖分子，释放出纤维二糖和葡萄糖。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于分析生物样品中C1的活性。其原理是C1可催化微晶纤维素降解产生还原糖，通过3,5－二硝基水杨酸法测定还原糖生成速率来计算其酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 3mL | 6mL | 4℃保存 |
试剂二 | 12.5mL | 25mL | 室温避光保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；常温避光保存，若有黄色晶体析出，需 90℃加热溶解后再用。
标准品：含10mg无水葡萄糖，临用前加入1mL去离子水溶解得10mg/mL标准品储液。10mg/mL标准品储液可4℃保存1个月或-20℃长期保存。取100µL10mg/mL标准品储液，加入100µL去离子水得5mg/mL的标准溶液。
注意：每次实验，请使用新配制的标准溶液。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
血清（浆）等液体样本:直接测定，根据预实验确定稀释倍数。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。 如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在1.5mLEP管中依次加入下列试剂）：
标准（μL） | 空白（μL） | 测定（μL） | 对照（μL） | |
样本 | 0 | 0 | 10 | 10 |
标准溶液 | 10 | 0 | 0 | 0 |
试剂一 | 0 | 0 | 100 | 0 |
去离子水 | 100 | 110 | 0 | 100 |
充分混匀，放入37℃水浴2h | ||||
试剂二 | 200 | 200 | 200 | 200 |
充分混匀，95℃水浴10min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中， 540nm处测定吸光值A，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照，标准和空白只需要测一次。
注意：1.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果A测大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 按样本质量计算
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位U。
Cx活性(U/g 质量)＝C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=458.33×(ΔA测÷ΔA标)÷W
2. 按液体样本体积计算
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位U。
Cx活性(U/mL)＝C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷V样÷T=458.33×(ΔA测÷ΔA标)
3. 按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活力单位U。
Cx活性(U/104 cell)= C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T=0.92×(ΔA测÷ΔA标)
4. 按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活力单位U。
Cx活性（U/mg prot）=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(Cpr×V样)÷T=458.33×(ΔA测÷ΔA标)÷Cpr
C标：标准溶液浓度，5mg/mL=5000ug/mL；V反总：反应体系总体积，0.11mL；W：样本质量，g；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2h，120min；500：细胞或细菌总数，500万；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
