产品简介
海藻糖是功能性低聚糖,具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结性等特性,是细胞在不良环境条件下产生的一种重要的抗逆应激物之一,它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用。海藻糖合成酶(Trehalose Synthase)催化麦芽糖合成海藻糖,是海藻糖生物合成的关键途径之一。本试剂盒可检测各种生物样本中的TS活性,其原理是TS催化麦芽糖产生海藻糖,使用糖化酶分解剩余麦芽糖为葡萄糖,通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量,按照麦芽糖减少的量表示海藻糖合酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 6mL | 12mL | 4℃保存 |
试剂二 | 6mL | 12mL | 4℃保存 |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 5mL | 10mL | 4℃避光保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测505nm处的吸光度)及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水、PBS
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
提取液:即用型;4℃保存。
试剂一:含4mM麦芽糖,即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂四:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
工作液配制:临用前将试剂三和试剂四按照 1:1 的比例混合,用多少配多少。
标准曲线设置:按下表所示用去离子水将 4 mmol/L 葡萄糖标准品稀释为 4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mmol/L 的标准溶液。
标准品体积 | 去离子水体积(µL) | 浓度(mmol/L) | |
Std.1 | 200 µL 4 mmol/L | 0 | 4 |
Std.2 | 100 µL of Std.1 (4 mmol/L) | 100 | 2 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (2 mmol/L) | 100 | 1 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (1 mmol/L) | 100 | 0.5 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (0.5 mmol/L) | 100 | 0.25 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (0.25 mmol/L) | 100 | 0.125 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (0.125 mmol/L) | 100 | 0.0625 |
注意:每次实验,请使用新配制的标准品。
样本制备
动植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次);8,000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上,调节波长到505nm,可见分光光度计去离子水调零。
2.样本测定(在EP管中加入如下试剂):
对照(μL) | 测定(μL) | |
样本 | 100 | 100 |
试剂一 | 0 | 100 |
混匀,40℃水浴反应2h,然后95℃水浴10min终止反应,冷却至室温。 | ||
试剂一 | 100 | 0 |
试剂二 | 100 | 100 |
混匀,60℃过夜反应(12h以上),10000g,25℃离心10min,取上清代测。 |
显色反应(在96孔板或微量玻璃比色皿加入如下试剂):
对照(μL) | 测定(μL) | 标准(μL) | 空白(μL) | |
样本上清液 | 20 | 20 | 0 | 0 |
不同浓度标准品 | 0 | 0 | 20 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 20 |
工作液 | 180 | 180 | 180 | 180 |
混匀,37℃反应30min,于505nm处读取吸光值;计算测定管ΔA测定=A对照-A测定,ΔA标准=A标准-A空白。
注意:1.空白和标准曲线只需测一次;每个样本测定需要设置一个对照。
2.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.5,样本可用去离子水进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1.标准曲线的绘制:
以标准液浓度为y轴,ΔA标为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。
将ΔA测定带入方程计算出y(mmol/L即µmol/mL)。
2.TS活性的计算:
(1)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol麦芽糖产生1nmol海藻糖定义为一个酶活力单位。
TS 活力(U/g 鲜重)=(4÷3-y÷2)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×1000=16.67×(1.333-0.5y)÷W
(2)按细胞或细菌数目计算
单位的定义:每1万个细胞或细菌在反应体系中每分钟催化1nmol麦芽糖产生1nmol海藻糖定义为一个酶活力单位。
TS 活力(U/104 cells)=(4÷3-y÷2)×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T×1000=0.033×(1.333-0.5y)
(3)按蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol麦芽糖产生1nmol海藻糖定义为一个酶活力单位。
TS 活力(U/mg prot)=(4÷3-y÷2)×V反总÷(Cpr×V样)÷T×1000=16.67×(1.333-0.5y)÷Cpr
4:试剂一中麦芽糖浓度,4mM即4µmol/mL;3:麦芽糖在显色前的稀释倍数,(100+100+100)/100=3;2:将葡萄糖摩尔浓度转化为麦芽糖摩尔浓度的系数,1分子麦芽糖可产生2分子葡萄糖;V反总:反应体系总体积, 0.2mL;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:提取时加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;T:反应时间,120min;1000,μmol到nmol 转换系数;500:细菌或细胞总数,500 万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。