产品简介
海藻糖是功能性低聚糖，具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结性等特性，是细胞在不良环境条件下产生的一种重要的抗逆应激物之一，它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用。海藻糖合成酶（Trehalose Synthase）催化麦芽糖合成海藻糖，是海藻糖生物合成的关键途径之一。本试剂盒可检测各种生物样本中的TS活性，其原理是TS催化麦芽糖产生海藻糖，使用糖化酶分解剩余麦芽糖为葡萄糖，通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量，按照麦芽糖减少的量表示海藻糖合酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 6mL | 12mL | 4℃保存 |
试剂二 | 6mL | 12mL | 4℃保存 |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 5mL | 10mL | 4℃避光保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测505nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水、PBS
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：含4mM麦芽糖，即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂四：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
工作液配制：临用前将试剂三和试剂四按照 1:1 的比例混合，用多少配多少。
标准曲线设置：按下表所示用去离子水将 4 mmol/L 葡萄糖标准品稀释为 4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mmol/L 的标准溶液。
标准品体积 | 去离子水体积（µL） | 浓度（mmol/L） | |
Std.1 | 200 µL 4 mmol/L | 0 | 4 |
Std.2 | 100 µL of Std.1 (4 mmol/L) | 100 | 2 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (2 mmol/L) | 100 | 1 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (1 mmol/L) | 100 | 0.5 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (0.5 mmol/L) | 100 | 0.25 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (0.25 mmol/L) | 100 | 0.125 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (0.125 mmol/L) | 100 | 0.0625 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）；8,000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到505nm，可见分光光度计去离子水调零。
2.样本测定（在EP管中加入如下试剂）：
对照（μL） | 测定（μL） | |
样本 | 100 | 100 |
试剂一 | 0 | 100 |
混匀，40℃水浴反应2h，然后95℃水浴10min终止反应，冷却至室温。 | ||
试剂一 | 100 | 0 |
试剂二 | 100 | 100 |
混匀，60℃过夜反应（12h以上），10000g，25℃离心10min，取上清代测。 | ||
显色反应（在96孔板或微量玻璃比色皿加入如下试剂）：
对照（μL） | 测定（μL） | 标准（μL） | 空白（μL） | |
样本上清液 | 20 | 20 | 0 | 0 |
不同浓度标准品 | 0 | 0 | 20 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 20 |
工作液 | 180 | 180 | 180 | 180 |
混匀，37℃反应30min，于505nm处读取吸光值；计算测定管ΔA测定=A对照-A测定，ΔA标准=A标准-A空白。
注意：1.空白和标准曲线只需测一次；每个样本测定需要设置一个对照。
2.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.5，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1．标准曲线的绘制：
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
将ΔA测定带入方程计算出y（mmol/L即µmol/mL）。
2．TS活性的计算：
（1）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol麦芽糖产生1nmol海藻糖定义为一个酶活力单位。
TS 活力(U/g 鲜重)=（4÷3-y÷2）×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×1000=16.67×(1.333-0.5y)÷W
（2）按细胞或细菌数目计算
单位的定义：每1万个细胞或细菌在反应体系中每分钟催化1nmol麦芽糖产生1nmol海藻糖定义为一个酶活力单位。
TS 活力(U/104 cells)=（4÷3-y÷2）×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T×1000=0.033×(1.333-0.5y)
（3）按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol麦芽糖产生1nmol海藻糖定义为一个酶活力单位。
TS 活力(U/mg prot)=(4÷3-y÷2）×V反总÷(Cpr×V样)÷T×1000=16.67×(1.333-0.5y)÷Cpr
4：试剂一中麦芽糖浓度，4mM即4µmol/mL；3：麦芽糖在显色前的稀释倍数，（100+100+100）/100=3；2：将葡萄糖摩尔浓度转化为麦芽糖摩尔浓度的系数，1分子麦芽糖可产生2分子葡萄糖；V反总：反应体系总体积， 0.2mL；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：提取时加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，120min；1000,μmol到nmol 转换系数；500：细菌或细胞总数，500 万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
