糖代谢系列

海糖合成酶(TS)检测试剂盒

货号:PMK1205
规格:48T/96T
价格:1080元/1800元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

海藻糖是功能性低聚糖,具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结性等特性,是细胞在不良环境条件下产生的一种重要的抗逆应激物之一,它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用。海藻糖合成酶(Trehalose Synthase)催化麦芽糖合成海藻糖,是海藻糖生物合成的关键途径之一。试剂盒可检测各种生物样本中的TS活性,其原理是TS催化麦芽糖产生海藻糖,使用糖化酶分解剩余麦芽糖为葡萄糖,通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量,按照麦芽糖减少的量表示海藻糖合酶活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

提取液

50mL

100mL

4℃保存

试剂一

6mL

12mL

4℃保存

试剂二

6mL

12mL

4℃保存

试剂三

5mL

10mL

4℃避光保存

试剂四

5mL

10mL

4℃避光保存

标准品

1mL

1mL

4℃保存

自备耗材

酶标仪或可见光分光光度计(能测505nm处的吸光度)及水浴锅

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

低温离心机、制冰机

去离子水、PBS

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

提取液:即用型;4℃保存

试剂一4mM麦芽糖,即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。

试剂四:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。

工作液配制:临用前将试剂三和试剂四按照 1:1 的比例混合,用多少配多少。

标准曲线设置:按下表所示用去离子水将 4 mmol/L 葡萄糖标准品稀释为 4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mmol/L 的标准溶液。


标准品体积

去离子水体积(µL)

浓度(mmol/L)

Std.1

200 µL 4 mmol/L

0

4

Std.2

100 µL of Std.1 (4 mmol/L)

100

2

Std.3

100 µL of Std.2 (2 mmol/L)

100

1

Std.4

100 µL of Std.3 (1 mmol/L)

100

0.5

Std.5

100 µL of Std.4 (0.5 mmol/L)

100

0.25

Std.6

100 µL of Std.5 (0.25 mmol/L)

100

0.125

Std.7

100 µL of Std.6 (0.125 mmol/L)

100

0.0625

注意:每次实验,请使用新配制的标准品

样本制备

物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次8,000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上,调节波长到505nm,可见分光光度计去离子水调零。

2.样本测定(在EP管中加入如下试剂):


对照μL)

测定(μL)

样本

100

100

试剂一

0

100

混匀40水浴反应2h,然后95水浴10min终止反应,冷却至室温。

试剂一

100

0

试剂二

100

100

混匀,60过夜反应(12h以上),10000g,25离心10min,取上清代测。

显色反应(在96孔板或微量玻璃比色皿加入如下试剂):


对照μL)

测定(μL)

标准(μL)

空白(μL)

样本上清液

20

20

0

0

不同浓度标准品

0

0

20

0

去离子水

0

0

0

20

工作液

180

180

180

180

混匀,37反应30min,于505nm处读取吸光值;计算测定管ΔA测定=A对照-A测定ΔA标准=A标准-A空白

注意:1.空白和标准曲线只需测一次;每个样本测定需要设置一个对照。

2.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA大于1.5,样本可用去离子水进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。

 

结果计算

1.标准曲线的绘制:

以标准液浓度为y轴,ΔAx轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)

ΔA测定带入方程计算出y(mmol/Lµmol/mL

2.TS活性的计算:

(1)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol麦芽糖产生1nmol海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS 活力(U/g 鲜重)=4÷3-y÷2)×V反总÷(W×V÷V样总)÷T×1000=16.67×(1.333-0.5y)÷W

(2)细胞或细菌数目计算

单位的定义:1万个细胞细菌在反应体系中每分钟催化1nmol麦芽糖产生1nmol海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS 活力(U/104 cells)=4÷3-y÷2)×V反总÷(500×V÷V样总)÷T×1000=0.033×(1.333-0.5y)

(3)按蛋白浓度计算

单位的定义:mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol麦芽糖产生1nmol海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS 活力(U/mg prot)=(4÷3-y÷2)×V反总÷(Cpr×V)÷T×1000=16.67×(1.333-0.5y)÷Cpr

4:试剂一中麦芽糖浓度,4mM即4µmol/mL3:麦芽糖在显色前的稀释倍数,(100+100+100)/100=3;2:将葡萄糖摩尔浓度转化为麦芽糖摩尔浓度的系数,1分子麦芽糖可产生2分子葡萄糖V反总反应体系总体积, 0.2mL;V:加入样本体积,0.1mL;V样总提取时加入提取液体积,1mLW:样本质量gCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;T:反应时间,120min1000,μmol到nmol 转换系数;500:细菌或细胞总数,500 万

结果展示

典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

图片43图片44

                      图片26

注意事项

1. 实验过程中请穿实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。


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