产品简介
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素P450和细胞色素b5是P450酶系的两个血红素蛋白，其比值的变化与P450代谢活性密切相关。本试剂盒为检测样本中的细胞色素P450提供了一种方便的工具。其原理是氧化型细胞色素b5经连二亚硫酸钠还原后，在424nm处有最大吸收峰，通过测定424nm和490nm处吸光值的差异，即可计算出细胞色素b5的含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×2瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 38mL | 76mL | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×2瓶 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测424nmnm和490nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机
去离子水
匀浆器或研钵
试剂准备
试剂一：临用前每瓶加100mL去离子水充分溶解。溶解后的试剂可4℃保存一周，也可分装-20℃长期保存，避免反复冻融。
试剂二: 即用型；使用前，平衡到室温；保存于4℃。
工作液: 临用前配制，戴一次性手套，小心打开试剂三瓶盖，每瓶试剂三加试剂二10mL充分溶解。溶解后的试剂可4℃避光保存一周，也可分装-20℃长期保存，避免反复冻融。
样本制备
样品中细胞色素b5提取：
1. 除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰浴匀浆，10,000g 4℃离心30min，取上清液，转入超速离心管中。
2. 粗制微粒体：100,000g，4℃离心60min，弃上清液。
3. 除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100,000g离心30min，弃上清液。
4.待测液制备：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，置冰上代测，该待测液需当天测定。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min。
2. 工作液置于25℃水浴中预热30min。
3. 测定：
空白管：在96孔板或微量玻璃比色皿中加入10μL去离子水，200μL工作液，室温静置2min，测定424nm和490nm处吸光值，424nm处吸光值记为A空白1，490nm处吸光值记为A空白2。△A空白= A空白1-A空白2。
测定管：在96孔板或微量玻璃比色皿中加入10μL待测液，200μL工作液，室温静置2min，测定424nm和490nm处吸光值，424nm处吸光值记为A测定1，490nm处吸光值记为A测定2。△A测定= A测定1-A测定2。
注意：只需要做一个空白。
实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，如果△A测定大于1.0，样本可用试剂二进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数；如果ΔΔA测小于0.001，可增加样本量进行检测。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
（1）按蛋白浓度计算
细胞色素b5含量(nmol/mg prot) =[ (△A测定-△A空白)×V反总÷(ε×d)]÷(Cpr×V样) = 245.6× (△A测定-△A空白)÷Cpr
（2）按样本质量计算
细胞色素b5含量（nmol/g 鲜重）=[ (△A测定-△A空白)×V反总÷(ε×d)]÷(W×V样÷V样总) = 122.8× (△A测定-△A空白)÷W
ε：还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数，171×10-6 L/nmol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，210 μL =2.1×10-4 L；Cpr：待测液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定；V样：加入反应体系中待测液体积，10 μL=0.01 mL；V样总：待测液总体积，0.5mL；W：样品质量，g。
B. 使用微量比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d：0.5cm调整为d：1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
