产品简介
异柠檬酸裂解酶（Isocitrate Lyase ,ICL；EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。在乙醛酸循环这一独特的代谢过程中，异柠檬酸裂解酶是关键酶之一。在反应系统中，异柠檬酸裂解酶催化异柠檬酸的分解，形成一分子乙醛酸和一分子琥珀酸。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的ICL活性检测方法，其原理是：ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，而NAD没有，在340nm下测定NADH的减小速率可间接反应ICL活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 7.5mL | 15mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
试剂三 | 0.25mL | 0.5mL | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机，低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；4℃保存。
工作液：将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂四：临用前配制，48T加入2mL去离子水，96T加入4mL去离子水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，15,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细菌或真菌：收集500万细菌或真菌到离心管内，用冷PBS清洗细菌或真菌，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后15,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。
2. 工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min。
3. 样本测定：在96孔UV板或微量石英比色皿中加入10μL样本、150μL工作液和40μL试剂四，混匀，记录340nm处1min时的吸光值A1和 3min时的吸光值A2，，计算ΔA=A1-A2。
注意：1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量或延长反应时间测量，注意计算公式中调整样品质量或时间；如果ΔA大于0.5，可用提取液稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/g 鲜重）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W
2）按细菌或真菌数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或真菌在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=6.43×ΔA
3）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
