产品简介

乙酸激酶(Acetate kinase)是在乙酸生成过程中的关键酶，它控制着乙酸的最终生成，广泛存在于各类生物体内。ACK催化乙酰磷酸和ADP生成乙酸和ATP的可逆反应，在生物体的碳源代谢和能量代谢中发挥着重要的作用，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的ACK活性检测方法，其原理是：ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP，丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。NADH在340nm处有特征吸收峰，而NAD+没有，在340nm下测定NADH生成NAD+速率，即可反映ACK活性。

产品内容

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

水浴锅、制冰机，低温离心机

去离子水

匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

提取液：即用型；4℃保存。

工作液：临用前取试剂二1瓶，加入10mL试剂一和200μL试剂三，充分混合溶解待用；现配现用。未用完的试剂分装-20℃保存，避免反复冻融。

样本制备

动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，15,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后15,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

血清、血浆或其它生物学液体：可直接用来检测，或者如果有必要，建议将样本根据预实验结果用提取液稀释后再进行检测。

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。

2. 工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min

3. 样本测定：在96孔UV板或微量石英比色皿中加入20μL样本和180μL工作液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A₁和3min20s后的吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂。

注意：1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量或延长反应时间测量，注意计算公式中调整样品质量或时间；如果ΔA大于1，可用提取液稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。

2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。

3.  因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。

结果计算

A. 使用96孔板测定的计算公式

1）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/g 鲜重）= [ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V_样÷V_样总) ÷T=1072×ΔA÷W

2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/10⁴ cell）=[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V_样÷V_样总)  ÷T=2.144×ΔA

3）按液体样本体积计算：

单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/mL）= [ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷×V_样÷T=1072×ΔA

4）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/mg prot）=[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V_样×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。

注意事项

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。

3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。

5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。