其它系列

乙酸激酶(ACK)检测试剂盒

货号:PMK1217
规格:48T/96T
价格:1740元/2900元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

乙酸激酶(Acetate kinase)是在乙酸生成过程中的关键酶,它控制着乙酸的最终生成广泛存在于各类生物体内ACK催化乙酰磷酸和ADP生成乙酸和ATP的可逆反应,在生物体的碳源代谢和能量代谢中发挥着重要的作用尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。试剂盒提供了一种简单、方便、快速的ACK活性检测方法,其原理是ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP,丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸,乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+NADH在340nm处有特征吸收峰,NAD+没有,340nm下测定NADH生成NAD+速率,即可反映ACK活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

提取液

50mL

100mL

4℃保存

试剂一

15mL

30mL

4℃保存

试剂二

粉剂×1

粉剂×2

-20℃保存

试剂三

0.25mL

0.5mL

-20℃保存

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)

96孔UV微孔或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

水浴锅制冰机,低温离心机

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

提取液:即用型;4℃保存。

工作液:临用前取试剂二1瓶,加入10mL试剂一和200μL试剂三,充分混合溶解待用;现配现用未用完的试剂分装-20℃保存,避免反复冻融。

样本制备

动植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,15,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞或细菌,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后15,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

血清、血浆或其它生物学液体:可直接用来检测,或者如果有必要,建议将样本根据预实验结果用提取液后再进行检测。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。

2. 工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min

3. 样本测定:96孔UV板或微量石英比色皿中加入20μL样本和180μL工作液,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A13min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2

注意:1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量延长反应时间测量,注意计算公式调整样品质量或时间;如ΔA1,可用提取液稀释样品,计算时结果乘以稀释倍数。

2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)。

3.  因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本

 

结果计算

A. 使用96孔板测定的计算公式

1)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK(U/g 鲜重)= [ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷(W×V÷V样总) ÷T=1072×ΔA÷W

2)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V÷V样总)  ÷T=2.144×ΔA

3)按液体样本体积计算:

单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK(U/mL= [ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷×V÷T=1072×ΔA

4)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,3 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。

注意事项

1. 实验过程中请穿实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。


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