产品简介
乙酸激酶(Acetate kinase)是在乙酸生成过程中的关键酶,它控制着乙酸的最终生成,广泛存在于各类生物体内。ACK催化乙酰磷酸和ADP生成乙酸和ATP的可逆反应,在生物体的碳源代谢和能量代谢中发挥着重要的作用,尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的ACK活性检测方法,其原理是:ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP,丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸,乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。NADH在340nm处有特征吸收峰,而NAD+没有,在340nm下测定NADH生成NAD+速率,即可反映ACK活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 15mL | 30mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×2瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 0.25mL | 0.5mL | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机,低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
提取液:即用型;4℃保存。
工作液:临用前取试剂二1瓶,加入10mL试剂一和200μL试剂三,充分混合溶解待用;现配现用。未用完的试剂分装-20℃保存,避免反复冻融。
样本制备
动植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,15,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞或细菌,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后15,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
血清、血浆或其它生物学液体:可直接用来检测,或者如果有必要,建议将样本根据预实验结果用提取液稀释后再进行检测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。
2. 工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min
3. 样本测定:在96孔UV板或微量石英比色皿中加入20μL样本和180μL工作液,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和3min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量或延长反应时间测量,注意计算公式中调整样品质量或时间;如果ΔA大于1,可用提取液稀释样品,计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)。
3. 因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本)。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(U/g 鲜重)= [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总) ÷T=1072×ΔA÷W
2)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=2.144×ΔA
3)按液体样本体积计算:
单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(U/mL)= [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷×V样÷T=1072×ΔA
4)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,3 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。