产品简介
植酸(Phytic acid),又名肌醇六磷酸、环己六醇六磷酸,它主要存在于植物的种子、根干和茎中,其中以豆科植物的种子、谷物的麸皮和胚芽中含量最高。植酸在植物发芽和生长过程中提供主要磷源,广泛存在于谷类、豆类、水果、蔬菜和干果等植物性食物中。另外,植酸作为螯合剂、抗氧化剂、保鲜剂、水的软化剂、发酵促进剂、金属防腐蚀剂等,广泛应用于食品、医药、油漆涂料、日用化工、金属加工、纺织工业、塑料工业及高分子工业等行业领域。 本试剂盒提供了一种简便的比色测定法,用于测定样本中的植酸含量。其原理是在一定的环境条件下,植酸酶可以分解植酸盐产生无机磷和肌醇衍生物,在酸性条件下,无机磷和钼酸铵显色剂发生反应,产生蓝色的钼蓝物质,其在700nm有特征吸收峰,通过测定无机磷的含量,可计算出植酸含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
提取液二 | 25mL | 50mL | 4℃保存 |
缓冲液 | 7.5mL | 15mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×2瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 7.5mL | 15mL | 4℃保存 |
显色剂 | 粉剂×2瓶 | 粉剂×4瓶 | 4℃保存 |
标准品(10μmol/mL 无机磷标准液) | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计(能测700nm处的吸光度)及恒温箱/水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机、震荡仪
去离子水、浓硫酸
匀浆器/研钵、40目筛
试剂准备
提取液一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
提取液一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
缓冲液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:临用前每瓶加缓冲液3mL配制,现用现配。用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
显色剂:临用前每瓶加0.8mL去离子水溶解,再加3.2mL试剂二混匀,现用现配;当天用完。
标准曲线设置:按下表所示用去离子水将10μmol/mL标准品稀释为8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μmol/ mL的标准溶液。
标准品体积(µL) | 去离子水体积(µL) | 标准品浓度(μmol/mL) | |
Std.1 | 800µL 10μmol/mL | 200 | 8 |
Std.2 | 100µL of Std.1 | 100 | 4 |
Std.3 | 100µL of Std.2 | 100 | 2 |
Std.4 | 100µL of Std.3 | 100 | 1 |
Std.5 | 100µL of Std.4 | 100 | 0.5 |
Std.6 | 100µL of Std.5 | 100 | 0.25 |
Std.7 | 100µL of Std.6 | 100 | 0.125 |
样本制备
新鲜植物样本:称取约 0.1g,加入1mL提取液一,充分匀浆后,常温震荡提取2h;8,000g,25℃离心10min,取上清0.5mL,加入0.5mL提取液二,混匀后4℃静置2h,4℃ 8,000g 离心 10min 后取上清待测。
干粉类植物样本:粉碎过40目筛,称取0.05g,加入1mL提取液一,充分匀浆后,常温震荡提取2h;8,000g,25℃离心10min,取上清0.5mL,加入0.5mL提取液二,混匀后4℃静置2h,4℃ 8,000g 离心 10min 后取上清待测。
液体样本:取 100μL 液体加入1mL 提取液一,充分混匀后,常温震荡提取2h;8,000g,25℃离心10min,取上清0.5mL,加入0.5mL试剂二,混匀后4℃静置2h,4℃ 8,000g 离心 10min 后取上清待测。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上,调节波长到700nm, 分光光度计去离子水调零。
2. 在EP管中依次加入下列试剂:
测定管(μL) | 对照管(μL) | 标准管(μL) | 空白管(μL) | |
样本 | 30 | 30 | 0 | 0 |
不同浓度标准品 | 0 | 0 | 30 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 30 |
37℃孵育5min | ||||
缓冲液 | 0 | 120 | 120 | 120 |
试剂一 | 120 | 0 | 0 | 0 |
混匀,37℃孵育30min | ||||
95℃,10min终止反应,冷却至室温 | ||||
显色剂 | 150 | 150 | 150 | 150 |
混匀,37℃静置15min,10000g,室温,离心5min,取上清200µL,测定700nm处吸光值,计算ΔA测=A测定-A对照,ΔA标=A标准-A空白。(空白和标准曲线只需测一次,每个测定管需要设置一个对照管)
注意:为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,如果ΔA测过高(高于1.2)可用提取液稀释样本后再测定,计算结果时注意乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴,ΔA标为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。
将 ΔA测 代入公式计算样本浓度(y,μmol/mL)。
1. 植酸含量计算
(1)按样本质量计算
植酸含量(μmol/g 质量)=y×V样÷(V样÷V样总×W)×2=2y÷W
(2)按照液体样本体积计算
植酸含量(μmol/mL)= y×V样÷V样×2=2y
V样:反应中样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g。
结果展示
典型标准曲线
1. 按样本质量计算
植酸含量(nmol/g 质量)= C标×(ΔA测÷ΔA标)=500×(ΔA测÷ΔA标)÷W
2. 按液体样本体积计算
植酸含量(nmol/mL)= C标×(ΔA测÷ΔA标)×V样÷(V样÷V样总×V液)×2=5000×(ΔA测÷ΔA标)
V样:加入反应体系中样本体积,0.1mL;V样总:样本处理后总体积,1mL;W:样本干重,g;V液:液体样本体积,0.1mL;2:样本处理时的稀释倍数,(0.5+0.5)/0.5=2。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。