产品简介
木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶系。在H2O2存在时，LiP能氧化分解芳香环多聚体，被认为是木质素降解的关键酶之一。LiP主要是由微生物分泌所产生，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。
本试剂盒提供了一种简便的比色测定法，用于测定样本中的LiP活性。其原理是木质素过氧化物酶催化天青脱甲基，在651nm处测定吸光值减少来计算LiP活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 2.5mL | 5mL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 2.5mL | 5mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计（能测651nm处的吸光度）及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
试剂一：临用前48T加入58mL去离子水，96T加入116mL去离子水，充分溶解待用，用不完的试剂可4℃保存一个月或分装-20℃长期保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液：每孔准备160µL工作液，现配现用：吸取80µL试剂一，40µL试剂二, 40µL试剂三, 混合均匀。
样本制备
组织：称取0.1g样本，加入1mL试剂一，冰浴匀浆，10,000g,4℃ 离心10min, 取上清液置冰上检测。
细菌或真菌：先收集细菌或真菌到离心管内，离心后弃上清；按500万细菌或真菌加入1mL试剂一的比例加入试剂一，冰浴超声波破碎5min (功率20%或200W, 超声3s, 间隔7s,重复30次),10,000g,4℃离心10min, 取上清液置冰上检测。
培养液等液体样本：直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上，调节波长到651nm, 分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定：在96孔板或微量比色皿中加入40μL样本和160μL工作液（μL）。充分混匀，记录651nm 处1min时的吸光值A1和6min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA小于0.001可适当加大样本量，如果 ΔA大于0.5，样本可用试剂一进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
A. 用96孔板测定的计算公式
1.按照样本质量计算
酶活性定义：每g组织在反应体系中每分钟A651变化0.005为一个酶活力单位。
LiP活性（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.005÷T =200×ΔA÷W
2.按照细菌或真菌细胞数量计算
酶活性定义：每1万个细菌或真菌在反应体系中每分钟A651变化0.005为一个酶活力单位。
LiP活性（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T=0.4×ΔA
3.按照液体体积计算
酶活性定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟A651变化0.005为一个酶活力单位。
LiP活性（U/mL）=ΔA×V反总÷V样 ÷0.005÷T =200×ΔA
4.按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟A651变化0.005为一个酶活力单位。
LiP活性（U/mg prot）= ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.005÷T =200×ΔA÷Cpr
B. 使用微量比色皿测定的计算公式
1.按照样本质量计算
酶活性定义：每g组织在反应体系中每分钟A651变化0.01为一个酶活力单位。
LiP活性（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.01÷T =100×ΔA÷W
2.按照细菌或真菌细胞数量计算
酶活性定义：每1万个细菌或真菌在反应体系中每分钟A651变化0.01为一个酶活力单位。
LiP活性（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T=0.2×ΔA
3.按照液体体积计算
酶活性定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟A651变化0.01为一个酶活力单位。
LiP活性（U/mL）=ΔA×V反总÷V样 ÷0.01÷T =100×ΔA
4.按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟A651变化0.01为一个酶活力单位。
LiP活性（U/mg prot）= ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T =100×ΔA÷Cpr
V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞数量，500万；T：反应时间，5min。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
