产品简介
亚铁氧化酶（Hsphasetin，HP）作为铜蓝蛋白的同系物,是近年来发现的铁转运蛋白。HP催化亚铁离子（Fe2+）氧化为三价铁离子（Fe3+），在介导铁的跨膜转运中有重要作用。本试剂盒提供了一种简便的比色测定法，用于测定样本中的HP活性。其原理是以一定浓度的 Fe2+为底物，在HP的催化作用下Fe2+被氧化为Fe3+，Fe2+可与菲咯嗪形成有色复合物，在562nm处有特征吸收峰，通过测定Fe2+的减少速率可测得亚铁氧化酶的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 0.75mL | 1.5mL | 4℃保存 |
试剂三 | 5.5mL | 11mL | 4℃，避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测 562nm处的吸光度）
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱或水浴锅、离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
样本制备
组织：称取0.1g组织，加入1mL预冷的去离子水，冰上匀浆。10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞和细菌：收集5×106个细胞或细菌，用冷PBS清洗细胞或细菌后弃上清，加入1mL预冷的去离子水，冰上匀浆。10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清、血浆或其它生物学液体：可直接测定，根据预实验确定稀释倍数。若溶液浑浊则离心取上清置于冰上待测。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上，调节波长到562nm，分光光度计去离子水调零。
2. 测定操作表（在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样）：
试剂 | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） |
试剂一 | 50 | 50 |
试剂二 | 10 | 10 |
样本 | 10 | 10 |
去离子水 | 30 | 30 |
试剂三 | 0 | 100 |
混匀，40℃静置30min |
混匀，立即测定A对照，无需孵育 | |
试剂三 | 100 | |
混匀，立即测定A测定，ΔA=A对照-A测定。(每个测定孔需设一个对照孔)。
注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA大于0.5，或测定孔有明显浑浊，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数；如果ΔA小于0.001，可增加样本量进行检测。
结果计算
标准状态下测定的曲线回归方程为：y=8.2135x-0.0006，R2=0.9998；(x为标准品浓度，μmol/mL；y为吸光值ΔA)
1. 按样本质量计算
单位定义：每g样本在反应体系中每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位U。
HP（U/g 鲜重）=（△A+0.0006）÷8.2135×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×1000=40.58×（△A+0.0006）÷W
2. 按液体体积计算
单位定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位U。
HP（U/mL）＝（△A+0.0006）÷8.2135×V反总÷V样÷T×1000=40.58×（△A+0.0006）
3. 按细胞数量计算
单位定义：每1万个细胞在反应体系中每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位U。
HP（U/104 Cells）＝（△A+0.0006）÷8.2135×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T×1000=0.081×（△A+0.0006）
4. 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟氧化1nmol Fe2+定义为一个酶活力单位U。
HP（U/mg prot）=（（△A+0.0006）÷8.2135×V反总÷(Cpr×V样)÷T×1000=40.58×（△A+0.0006）÷Cpr
V反总：反应体系体积，0.1mL；V样：加入样本体积0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞总数，500万；1000，μmol到nmol的转换系数。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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