产品简介
高铁还原酶(ferric-chelate reductase, FCR)催化高价铁螯合物中的Fe3+还原为Fe2+,在部分物种铁元素的吸收中有重要作用。本试剂盒提供了一种简便的比色测定法,用于测定样本中的FCR活性。其原理是FCR催化Fe3+还原为Fe2+,Fe2+和ferrozine反应显色,在562nm下有特征吸光值。通过测定Fe2+增加的速率可测得高铁还原酶的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 3mL | 6mL | 4℃,避光保存 |
试剂二 | 3mL | 6mL | 4℃,避光保存 |
试剂三 | 3mL | 6mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计(能测 562nm处的吸光度)
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱或水浴锅、离心机、制冰机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
工作液配制:将试剂一、二、三以1:1:1的比例混合。临用前配制,用多少配多少。
样本制备
组织:称取0.1g组织,加入1mL预冷的去离子水,冰上匀浆。10,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
细胞和细菌:收集5×106个细胞或细菌,用冷PBS清洗细胞或细菌后弃上清,加入1mL预冷的去离子水,冰上匀浆。10,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
血清、血浆或其它生物学液体:可直接测定,根据预实验确定稀释倍数。若溶液浑浊则离心取上清置于冰上待测。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上,调节波长到562nm,分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定:在96孔板或微量玻璃比色皿中加入50μL样本上清和150μL工作液,混匀,记录初始吸光值A1和30min后的吸光值A2。ΔA=A2-A1。
注意:实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验,如果ΔA大于0.5,样本可用去离子水进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数;如果ΔA小于0.001,可增加样本量进行检测。
结果计算
标准状态下测定的曲线回归方程为:y=8.0014x+0.0011,R2=0.9997;(x为标准品浓度,μmol/mL;y为吸光值ΔA)
1. 按样本质量计算
单位定义:每g样本在反应体系中每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位U。
FCR(U/g)=(△A-0.0011)÷8.0014×1000×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=16.664×(△A-0.0011)÷W
2. 按液体体积计算
单位定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位U。
FCR(U/mL)=(△A-0.0011)÷8.0014×1000×V反总÷V样÷T=16.664×(△A-0.0011)
3. 按细胞数量计算
单位定义:每1万个细胞在反应体系中每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位U。
FCR(U/104 Cells)=(△A-0.0011)÷8.0014×1000×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T=0.033×(△A-0.0011)
4. 按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg蛋白在反应体系中每分钟产生1nmolFe2+-ferrozine定义为一个酶活力单位U。
FCR(U/mg prot)=(△A-0.0011)÷8.0014×1000×V反总÷(Cpr×V样)÷T=16.664×(△A-0.0011)÷Cpr
V反总:反应体系体积,0.2mL;V样:加入样本体积0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min;W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;500:细胞总数,500万;1000,μmol到nmol的转换系数。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。
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