产品简介
PEPCK（EC 4.1.1.32）广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷 酸烯醇式丙酮酸，是调节糖异生途径的关键酶。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本中PEPCK的活性。其原理是PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+。NADH在340nm有特征吸收峰，相反NAD+在该波长无吸收峰，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 9mL | 18mL | 4℃保存 |
试剂二 | 50μL | 100μL | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）及恒温箱
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：小管试剂开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂四：临用前在试剂四瓶中48T加入0.5mL去离子水，96T加入1mL去离子水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清等液体样本：直接测定。
注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1．酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计去离子水调零。
2．工作液和试剂四置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）孵育10min。
3．样本测定：在96 孔UV微孔板或微量石英比色皿中加入10μL样本、10μL试剂四和180μL工作液，立即混匀。记录340nm处初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于0.3，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
A. 使用 96孔UV板测定的计算公式如下
1. 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK(U/g 鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=6431×ΔA÷W
2. 按液体样本体积计算：
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=6431×ΔA
3. 按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每 104个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK(U/104 Cells)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=6431×ΔA÷500=12.86×ΔA
4. 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK(U/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=6431×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm； 109：1mol=1×109 nmol；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g； 500：细菌或细胞总数，5×106。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
PMK1234 葡萄糖-6-磷酸酶（G6P)检测试剂盒（微量法）
PMK1235 果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)/果糖-1,6-二磷酸酯酶检测试剂盒（微量法）
PMK1236 丙酮酸羧化酶（PC）检测试剂盒（NADH速率法/微量法）
PMK1885 丙酮酸羧化酶（PC）检测试剂盒（微量法）
PMK1116 丙酮酸（PA）检测试剂盒（微量法）
PMK1006 丙酮酸脱羧酶（PDC）检测试剂盒（微量法）
PMK1121 丙酮酸激酶（PK）检测试剂盒（微量法）
PMK1123 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）检测试剂盒（微量法）
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