产品简介

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。它是供给草酰乙酸的主要补充反应，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖异生过程的第一个限速酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本中PC的活性。其原理是PC催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。

产品内容

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）及水浴锅

96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

低温离心机、制冰机

去离子水

匀浆器

试剂准备

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

提取液：即用型；4℃保存。

工作液：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。

试剂四：临用前在试剂四瓶中48T加入0.5mL去离子水，96T加入1mL去离子水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。

样本制备

组织、真菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 称取约0.1g组织或收集500万真菌或细胞，加入1mL提取液，冰浴匀浆。

2. 将匀浆液600g，4℃离心5min。

3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做）。

5. 在步骤4的沉淀中加入1mL提取液，超声波破碎5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），用于线粒体PC活性测定。

注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

2. 对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。

实验步骤

1．酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计去离子水调零。

2．工作液置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育10min。

3．样本测定：在96 孔UV微孔板或微量石英比色皿中加入10μL样本、10μL试剂四和180μL工作液，立即混匀。记录340nm处初始吸光值A₁和 2min后的吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于0.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

A. 使用 96孔板测定的计算公式如下

1. 按样本鲜重计算

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

上清中PC活力计算：

上清中PC活力(U/g 鲜重)＝[ΔA₁×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样÷V_提取×W)÷T=3215×ΔA₁÷W

沉淀中PC活力计算：

沉淀中PC活力(U/g 鲜重)＝[ΔA₂×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样÷V_重悬×W)÷T=3215×ΔA₂÷W

样本中PC总活力的计算：

PC总活力即为上清中PC活力与沉淀中PC活力之和。

PC总活力(U/g 鲜重)=3215×ΔA₁÷W+3215×ΔA₂÷W=3215×(ΔA₁+ΔA₂)÷W

2. 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白在反应体系每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

上清中PC活力计算：

上清中PC活力(U/mg prot)＝[ΔA₁×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V_样)÷T=3215×ΔA₁÷Cpr

沉淀中PC活力计算：

沉淀中PC活力(U/mg prot)＝[ΔA₂×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V_样)÷T=3215×ΔA₂÷Cpr

样本中PC总活力的计算：

PC总活力即为上清中PC活力与沉淀中PC活力之和。

PC总活力(U/mg prot)=3215×ΔA₁÷Cpr+3215×ΔA₂÷Cpr=3215×(ΔA₁+ΔA₂)÷Cpr

3，按真菌或细胞数量计算：

单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

上清中PC活力计算：

上清中PC活力(U/10⁴ Cells)＝[ΔA₁×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样÷V_提取×500)÷T=6.43×ΔA₁

沉淀中PC活力计算：

沉淀中PC活力(U/10⁴ Cells)＝[ΔA₂×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样÷V_重悬×500)÷T=6.43×ΔA₂

样本中PC总活力的计算：

PC总活力即为上清中PC活力与沉淀中PC活力之和。

PC总活力(U/10⁴ Cells)=6.43×ΔA₁+6.43×ΔA₂=6.43×(ΔA₁+ΔA₂)

ΔA₁：上清测定值；ΔA₂：沉淀测定值；V_提取：提取体系体积，1mL；V_重悬：重悬沉淀体积，1mL；V_反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm； 10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol； V_样：加入样本体积，0.01mL；V_样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g； 500：真菌或细胞总数，5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。

注意事项

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。

3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。

4. 
不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。

5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。