产品简介
维生素 B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一 种水溶性维生素，肉类、全谷类、蔬菜和坚果类中含量较高。在机体中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于分析各种生物样品中维生素 B6含量。其原理是 VB6 与 4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在 400nm 有特征吸收峰。通过测定400nm下吸光度来计算VB6 含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 35mL | 70mL | 4℃保存 |
试剂一 | 4mL | 4mL | 4℃保存 |
试剂二 | 2.5mL | 5mL | 4℃保存 |
试剂三 | 4mL | 8mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 4mL | 8mL | 4℃避光保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测400nm处的吸光度）及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂四：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
标准品：10mg维生素B6，临用前加入1mL试剂一，配成10mg/mL的标准液。溶解后的标准品可4℃保存1个月或-20℃长期保存。
标准曲线设置：按下表所示，用试剂一将10mg/mL标准品稀释为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL 的标准溶液。
标准品体积（µL） | 试剂一体积（µL） | 标准品浓度（mg/mL） | |
标准品1 | 16µL 10mg/mL | 384 | 0.4 |
标准品2 | 200µL of 标准品1 (0.4mg/mL) | 200 | 0.2 |
标准品3 | 200µL of 标准品2 (0.2mg/mL) | 200 | 0.1 |
标准品4 | 200µL of 标准品3 (0.1mg/mL) | 200 | 0.05 |
标准品5 | 200µL of 标准品4 (0.05mg/mL) | 200 | 0.025 |
标准品6 | 200µL of 标准品5 (0.025mg/mL) | 200 | 0.0125 |
标准品7 | 200µL of 标准品6 (0.0125mg/mL) | 200 | 0.00625 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入0.6mL提取液匀浆，60℃浸提 30min，加去离子水 0.4mL，混匀后于 25℃，16000 rpm 离心 10min，取上清测定（动物组织及其他蛋白含量较高的样本建议离心 20-30 分钟或反复离心 2-3 次至上清无混浊）。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入0.6mL提取液，超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），60℃浸提 30min，加去离子水 0.4mL，混匀后于 25℃，16000rpm 离心 10min，取上清测定。
液体样本：直接检测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。 如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到400nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：
标准（μL） | 空白（μL） | 测定（μL） | 对照（μL） | |
样本 | 0 | 0 | 40 | 40 |
试剂一 | 0 | 40 | 0 | 0 |
标准品 | 40 | 0 | 0 | 0 |
试剂二 | 40 | 40 | 40 | 40 |
试剂三 | 60 | 60 | 60 | 60 |
试剂四 | 60 | 60 | 60 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 60 |
充分混匀，25℃反应20min，400nm处测定吸光值A，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照，空白和标准曲线只需要测一次。
注意：1.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测定大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。蛋白浓度较高的样本，比如动物组织、豆类种子等，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制：
以标准品浓度为y轴，ΔA标准为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测定带入方程计算出y值（mg/mL）。
2. 样本维生素B6含量计算
（1）按样本质量计算：VB6（mg/g质量）=y×V提取÷W=y÷W
（2）按液体样本体积计算：VB6（mg/mL）=y×V样÷V样=y
（3）按细胞或细菌细胞数量计算：VB6（mg/104 cells）=y×V提取÷细胞数量（万个）=y÷细胞数量
（4）按蛋白浓度计算：VB6（mg/mg prot）=y×V样÷（V样×Cpr）=y÷Cpr
V提取：样本提取体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；细胞数量：以万为单位。
结果展示
典型标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
