产品简介
1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco, EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性直接影响着光合速率。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测植物组织样本的Rubisco的活性，其原理是在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）；PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着NADH氧化生成NAD+；在340nm NADH有特征吸收峰，而NAD+没有此吸收峰，因此测定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
提取液二 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 12.5mL | 25mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
试剂三 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
试剂四 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
提取液二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前配制，对于48T，加5mL 试剂一溶解；对于96T，加10mL 试剂一溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
试剂三：临用前配制，对于48T，加5mL 试剂一溶解；对于96T，加10mL 试剂一溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
试剂四：临用前配制，对于48T，加0.5mL 试剂一溶解；对于96T，加1mL 试剂一溶解，混匀备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
工作液：临用前将溶解后的试剂二和溶解后的试剂三按1：1混合，根据实验需求配制相应的体积。
样本制备
粗酶液制备：
1. 总Rubisco酶提取：称取约0.1g样本，加入1mL 提取液一，冰浴匀浆，超声波破碎1min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s），8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
2. 胞浆和叶绿体Rubisco酶的分离：称取约0.1g样本，加入1mL 提取液一，冰浴匀浆，200g，4℃离心5 min，弃沉淀，取上清在8,000 g，4℃离心10min，离心后取上清用于测定胞浆Rubisco酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎1min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s），8,000g，4℃离心10min，取上清测定叶绿体中Rubisco酶活性。
注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。建议测定总Rubisco酶活性，按照步骤1提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco，则按照步骤2提取粗酶液。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作）：
空白孔（μL） | 测定孔（μL） | |
样本 | 0 | 10 |
去离子水 | 10 | 0 |
试剂四 | 10 | 10 |
工作液 | 180 | 180 |
3. 迅速混匀后于340nm检测，记录20s和5min 20s的吸光值，测定孔的记为A1和A2，空白孔的记为A3和A4，计算ΔA测=(A1-A2)-(A3-A4)。
注意：空白孔只需测定1次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
结果计算
A. 使用96孔UV微孔板测定的计算公式
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：25℃中，每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。
Rubisco(U/mg prot)=[ΔA测×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×Cpr)÷T=1286×ΔA测÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：25℃中，每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。
Rubisco(U/g 质量)=[ΔA测×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样本)÷T=1286×ΔA测÷W
V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4 L，V提取：提取液体积，1mL；V样本：反应体系中上清液体积，0.01mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板直径，0.5cm；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；T：反应时间，5min；W：样本质量，g。
B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
