产品简介
测定原理
果胶酶(pectinase)是分解果胶的酶类,包括原果胶酶,果胶酯酶,多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类, 广泛存在于高等植物果实和微生物中,是水果加工中最重要的酶。主要用于食品、酿酒、环保、医药、纺织及日化用品行业。本试剂盒提供了一种简单的检测方法,可检测样本中果胶酶活性,其原理是果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,半乳糖醛酸与DNS试剂反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质,测定540nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 100mL×1瓶 | 100mL×2瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×2瓶 | 4℃保存 |
DNS试剂 | 10mL | 20mL | 4℃避光保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计(能测540nm处的吸光度)及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:临用前每瓶加入7.5mL试剂一,50℃加热溶解,用不完的试剂4℃保存一周。
DNS试剂:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
标准品:10mg 半乳糖醛酸,使用时加入0.943mL 去离子水,配成 50μmol/mL 的标准贮备液。取10μL 50μmol/mL 的标准贮备液,加入90μL去离子水,充分混匀,配制成5μmol/mL标准液使用,现用现配。
样本制备
组织:称取约0.1g组织,加入1mL提取液,冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
细菌:收集500万细菌细胞加入1mL提取液,冰浴超声波破碎细胞3min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s);然后10000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。
细胞培养液等:直接检测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到540nm,可见光分光光度计去离子水调零。
2. 煮沸样本的准备:取200μL样本至新的EP管中,沸水浴5min,冷却至室温后,8000g 4℃离心 10min,取上清作为对照管的煮沸样本待测。
3. 操作表(在EP管中按照如下方式加样):
空白管(μL) | 标准管(μL) | 测定管(μL) | 对照管(μL) | |
试剂二 | 120 | 120 | 120 | 120 |
50℃水浴5min | ||||
去离子水 | 30 | 0 | 0 | 0 |
标准液 | 0 | 30 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 30 | 0 |
煮沸样本(沸水浴5min) | 0 | 0 | 0 | 30 |
混匀50℃水浴反应30min | ||||
DNS试剂 | 150 | 150 | 150 | 150 |
充分混匀,沸水浴5min,,冰浴冷却终止反应,8000g,4℃,离心10min,取200μL于到96孔板或微量玻璃比色皿中测定540nm处吸光度,空白孔记为A空,标准孔记为A标,测定孔记为A测。计算ΔA测=A测-A对,ΔA标=A标-A空(空白管和标准管只需测定1次,每个测定管需设一个对照管)。
注意:。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于1.0,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。
结果计算
果胶酶活性的计算:
1.按样本质量计算
酶活定义:在50℃,pH3.5条件下,每克样本在反应体系中每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1个酶活力单位。
果胶酶活性(U/g 质量)= C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=50×(ΔA测÷ΔA标)÷W
2.按照细菌数量计算
酶活定义:在50℃,pH3.5条件下,每104个细菌在反应体系中每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1 个酶活力单位。
果胶酶活性(U/104 cell)=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T=0.1×(ΔA测÷ΔA标)
3.按蛋白浓度计算
酶活定义:在50℃,pH3.5条件下,每毫克蛋白在反应体系中每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。
果胶酶活性(U/mg prot)=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(Cpr×V样)÷T=50×(ΔA测÷ΔA标)÷Cpr
4.按液体体积计算
酶活定义:在50℃,pH3.5条件下,每mL样本在反应体系中每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1个酶活力单位。
果胶酶活性(U/mL)==C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷V样÷T=50×(ΔA测÷ΔA标)
C标:标准液浓度,5μmol/mL;V反总:反应体系总体积,0.15mL;V样:加入的样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5h;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;500:细菌数量,500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。