产品简介
测定原理
果胶酶（pectinase）是分解果胶的酶类，包括原果胶酶，果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类， 广泛存在于高等植物果实和微生物中，是水果加工中最重要的酶。主要用于食品、酿酒、环保、医药、纺织及日化用品行业。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，可检测样本中果胶酶活性，其原理是果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸与DNS试剂反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，测定540nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 100mL×1瓶 | 100mL×2瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×2瓶 | 4℃保存 |
DNS试剂 | 10mL | 20mL | 4℃避光保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测540nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前每瓶加入7.5mL试剂一，50℃加热溶解，用不完的试剂4℃保存一周。
DNS试剂：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
标准品：10mg 半乳糖醛酸，使用时加入0.943mL 去离子水，配成 50μmol/mL 的标准贮备液。取10μL 50μmol/mL 的标准贮备液，加入90μL去离子水，充分混匀，配制成5μmol/mL标准液使用，现用现配。
样本制备
组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
细菌：收集500万细菌细胞加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞3min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。
细胞培养液等：直接检测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 煮沸样本的准备：取200μL样本至新的EP管中，沸水浴5min，冷却至室温后，8000g 4℃离心 10min，取上清作为对照管的煮沸样本待测。
3. 操作表（在EP管中按照如下方式加样）：
空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） | 对照管（μL） | |
试剂二 | 120 | 120 | 120 | 120 |
50℃水浴5min | ||||
去离子水 | 30 | 0 | 0 | 0 |
标准液 | 0 | 30 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 30 | 0 |
煮沸样本（沸水浴5min） | 0 | 0 | 0 | 30 |
混匀50℃水浴反应30min | ||||
DNS试剂 | 150 | 150 | 150 | 150 |
充分混匀，沸水浴5min，，冰浴冷却终止反应，8000g，4℃，离心10min，取200μL于到96孔板或微量玻璃比色皿中测定540nm处吸光度，空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空（空白管和标准管只需测定1次，每个测定管需设一个对照管）。
注意：。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于1.0，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
果胶酶活性的计算：
1.按样本质量计算
酶活定义：在50℃，pH3.5条件下，每克样本在反应体系中每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1个酶活力单位。
果胶酶活性（U/g 质量）= C标×（ΔA测÷ΔA标）×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=50×（ΔA测÷ΔA标）÷W
2.按照细菌数量计算
酶活定义：在50℃，pH3.5条件下，每104个细菌在反应体系中每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1 个酶活力单位。
果胶酶活性（U/104 cell）=C标×（ΔA测÷ΔA标）×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T=0.1×（ΔA测÷ΔA标）
3.按蛋白浓度计算
酶活定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫克蛋白在反应体系中每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。
果胶酶活性（U/mg prot）=C标×（ΔA测÷ΔA标）×V反总÷(Cpr×V样)÷T=50×（ΔA测÷ΔA标）÷Cpr
4.按液体体积计算
酶活定义：在50℃，pH3.5条件下，每mL样本在反应体系中每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1个酶活力单位。
果胶酶活性（U/mL）==C标×（ΔA测÷ΔA标）×V反总÷V样÷T=50×（ΔA测÷ΔA标）
C标：标准液浓度，5μmol/mL；V反总：反应体系总体积，0.15mL；V样：加入的样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5h；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细菌数量，500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
