淀粉系列

α-淀粉酶检测试剂盒(微量法)

货号:PMK1155
规格:48T/96T
价格:350元/580元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介


淀粉酶负责水解淀粉,包括α-淀粉酶(α-AL,EC 3.2.1.1)和β-淀粉酶(β-AL)。α-淀粉酶随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。α-淀粉酶分布十分广泛,遍及微生物乃至高等植物。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中α-淀粉酶活性,其原理是淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖,还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质,在540nm有吸收峰;通过测定540 nm吸光度增加速率,计算淀粉酶活性。α-淀粉酶耐热,但是β-淀粉酶在70℃下15min可钝化。因此粗酶液经过70℃钝化15min,就只有α-淀粉酶能够催化淀粉水解。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

DNS 试剂

20mL

40mL

室温避光保存

底物

1

1

4℃

标准品

1

1

4℃

自备耗材

酶标仪或可见光分光光度计(能测540nm处的吸光度)

水浴锅、离心机

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

DNS 试剂:即用型;使用前,平衡到室温;室温避光保存(若有黄色晶体析出,需加热到90℃溶解)。

底物:临用前96T加入 20 mL去离子水,48T加入 10 mL去离子水上下颠倒摇晃几次,加热至溶解。溶解后的底物 4℃保存,若有沉淀析出,可70℃加热溶解后使用。

标准品:含10 mg无水葡萄糖,临用前加入1mL去离子水溶解得10 mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或-20℃长期保存。

标准曲线设置:按下表所示,用去离子水将10 mg/mL标准品稀释为10.50.250.1250.06250.03130.0156 mg/mL 的标准溶液。


标准品体积(µL

去离子水体积(µL

标准品浓度(mg/mL

标准品1

40µL 10mg/mL

360

1

标准品2

200µL of 标准品1 (1mg/mL)

200

0.5

标准品3

200µL of 标准品2 (0.5mg/mL)

200

0.25

标准品4

200µL of 标准品3 (0.25mg/mL)

200

0.125

标准品5

200µL of 标准品4 (0.125mg/mL)

200

0.0625

标准品6

200µL of 标准品5 (0.0625mg/mL)

200

0.0313

标准品7

200µL of 标准品6 (0.0313mg/mL)

200

0.0156

注意:每次实验,请使用新配制的标准品

样本制备

注意:

1. 动物组织:称取约0.1g样本,加入1mL去离子水匀浆,将匀浆倒入离心管中,在室温下放置15min,每隔5min振荡1次,使其充分提取。6,000g,室温离心10min,吸取上清液并且加去离子水定容至10mL,摇匀,即为淀粉酶原液。

2. 植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL去离子水捣碎,超声波破碎 5min(功率20%,超声3s,间隔7s,重复30次),在室温下放置15min,每隔5min振荡1次,使其充分提取。6,000g,室温离心10min,吸取上清液并且加去离子水定容至10mL,摇匀,即为淀粉酶原液。

3. 血清(浆)和唾液等液体样本:直接测定。建议预实验确定合适的稀释倍数。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存6个月。对于脂肪含量较高的动物组织,离心后移除上层脂肪,再取上清液。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上,调节波长到540nm,可见分光光度计去离子水调零。

2. 水浴锅预热到70℃。

3. 75μL样本沸水浴5min作为对照管使用。

4. 样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):

试剂名称

空白管(μL)

标准管(μL)

测定管(μL)

对照管(μL)

去离子水

75

0

0


不同浓度标准品

0

75

0


样本

0

0

75

75(煮沸样本)

70℃水浴15min,冷却

底物

0

0

75

0

去离子水

75

75

0

0

40℃恒温水浴中保温5min

DNS试剂

150

150

150

150

底物

0

0

0

75

5. 混匀,沸水浴5min,冷却,取200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中,测定540nm处的吸光值,计算ΔA测定=A测定-A对照ΔA标准=A标准-A空白

注意:每个样本需设置一个对照管,空白管只需做1管。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本A测定大于2,则说明样本酶活力太高,必须用去离子水稀释成适当浓度(计算公式中乘以相应稀释倍数)。若ΔA测定小于0.005可以重新提取样本减少去离子水定容的体积。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准液浓度为y轴,ΔA标准x轴,绘制标准曲线。将ΔA测定带入方程得到y值(mg/mL)。

2. α-淀粉酶活性计算

1)按样本鲜重计算

单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

 α-淀粉酶活性(U/g 质量)=y×V反总÷(W×V÷V样总)÷T×n=4×y÷W×n  

2)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

 α-淀粉酶活性U/mg prot)=y×V反总÷(Cpr×V)÷T×n=0.4×y÷Cpr×n  

3)按液体样本体积计算

单位的定义:每升液体样本在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/mL)=y×V反总÷V÷T×n=0.4×y×n

V反总:反应体系总体积0.15mL;V:加入反应体系中样本体积,0.075mL;W:样本质量,g;V样总:样本总体积,10mL;T:反应时间,5min; n:样本稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL

结果展示

典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

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