产品简介
淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶（α-AL）和β-淀粉酶（β-AL，EC 3.2.1.2）。β-淀粉酶从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中β-淀粉酶活性。其原理是淀粉酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在540nm有吸收峰；通过测定540nm吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。α-淀粉酶耐热，但是β-淀粉酶在70℃下15 min可钝化。因此粗酶液经过70℃钝化15 min，就只有α-淀粉酶能够催化淀粉水解。用不钝化的粗酶液测出总淀粉酶活性，减去α-淀粉酶就可得到β-淀粉酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
DNS试剂 | 35mL | 70mL | 室温避光保存。 |
底物 | 1 | 1 | 4℃ |
标准品 | 1 | 1 | 4℃ |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光度）
水浴锅、离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
DNS 试剂：即用型；使用前，平衡到室温；室温避光保存（若有黄色晶体析出，需加热到90℃溶解）。
底物：临用前96T加入 35mL去离子水，48T加入 17.5mL去离子水，上下颠倒摇晃几次，加热至溶解。溶解后的底物 4℃保存，若有沉淀析出，可70℃加热溶解后使用。
标准品：含10 mg无水葡萄糖，临用前加入1mL去离子水溶解得10 mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或-20℃长期保存。
标准曲线设置：按下表所示，用去离子水将10mg/mL标准品稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mg/mL 的标准溶液。
标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（mg/mL） | |
标准品1 | 40µL 10mg/mL | 360 | 1 |
标准品2 | 200µL of 标准品1 (1mg/mL) | 200 | 0.5 |
标准品3 | 200µL of 标准品2 (0.5mg/mL) | 200 | 0.25 |
标准品4 | 200µL of 标准品3 (0.25mg/mL) | 200 | 0.125 |
标准品5 | 200µL of 标准品4 (0.125mg/mL) | 200 | 0.0625 |
标准品6 | 200µL of 标准品5 (0.0625mg/mL) | 200 | 0.0313 |
标准品7 | 200µL of 标准品6 (0.0313mg/mL) | 200 | 0.0156 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
1. 动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL去离子水匀浆，将匀浆倒入离心管中，在室温下放置15min，每隔5min振荡1次，使其充分提取。6,000g，室温离心10min，吸取上清液并且加去离子水定容至10mL，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL，加入4mL去离子水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于(α＋β)淀粉酶总活力的测定。
2. 植物组织，称取约0.1g样本，加入1mL去离子水捣碎，超声波破碎 5min（功率20%，超声3s，间隔7s，重复30次），在室温下放置15min，每隔5min 振荡1次，使其充分提取。6,000g，室温离心10min，吸取上清液并且加去离子水定容至10mL，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL，加入4mL去离子水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于(α＋β)淀粉酶总活力的测定。
3. 血清（浆）和唾液等液体样本：直接测定，建议预实验确定合适的稀释倍数，适当稀释的液体样本即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL，加入4mL蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于(α＋β)淀粉酶总活力的测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零；水浴锅预热到70℃。
2. 每个样本取2支EP管分别加入75μL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液，沸水浴5min，分别作为α-淀粉酶对照管和总淀粉酶对照管使用。
3. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
标准曲线的测定 | α-淀粉酶活力测定 | 总淀粉酶活力测定 | ||||
标准管 （μL） | 空白管 （μL） | 测定管 （μL） | 对照管 （μL） | 测定管 （μL） | 对照管 （μL） | |
不同浓度标准品 | 75 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
去离子水 | 0 | 75 | 0 | 0 | 0 | 0 |
淀粉酶原液 | 0 | 0 | 75 | 75（煮沸原液） | 0 | 0 |
70℃水浴15min，冷却 | ||||||
淀粉酶稀释液 | 0 | 0 | 0 | 0 | 75 | 75（煮沸稀释液） |
底物 | 0 | 0 | 75 | 0 | 75 | 0 |
去离子水 | 75 | 75 | 0 | 0 | 0 | 0 |
40℃恒温水浴中保温5min | ||||||
DNS试剂 | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
底物 | 0 | 0 | 0 | 75 | 0 | 75 |
4. 混匀，沸水浴5min，冷却，取200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中，测定540nm处的吸光值，计算ΔA α=A测定α-A对照α；ΔA总=A测定总-A对照总；ΔA标准=A标准-A空白。
注意：每个样本需分别设置α-淀粉酶活力测定对照和总淀粉酶活力测定对照，空白管只需做1管。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本A测定大于2，则说明样本酶活力太高，必须用去离子水稀释成适当浓度（计算公式中乘以相应稀释倍数）。若样本ΔA测定小于0.005可以重新提取样本减少去离子水定容的体积。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标准为x轴，绘制标准曲线。将ΔA α带入方程得到y1值（mg/mL），ΔA总带入方程得到y2值（mg/mL）。
2. α-淀粉酶活性计算
（1）按样本质量计算
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶活性(U/g 质量)=y1×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×n=4×y1÷W×n
（2）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶活性（U/mg prot）=y1×V反总÷（Cpr×V样）÷T×n=0.4×y1÷Cpr×n
（3）按液体样本体积计算
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1 mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶活性(U/mL)=y1×V反总÷V样÷T×n=0.4×y1×n
3. 总淀粉酶活性计算：
（1）按照样本质量计算
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性 (U/g 质量)=5×y2×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×n=20×y2÷W×n
（2）按照蛋白质含量计算
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×y2×V反总÷(V样×Cpr)÷T×n=2×y2÷Cpr×n
（3）按液体样本体积计算
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(U/L)=5×y2×V反总÷V样÷T×n=2×y2×n
4. β-淀粉酶活性计算：
（1）按照样本质量计算
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性（U/g 质量）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(20×y2÷W×n)-(4×y1÷W×n)
=(20×y2-4×y1)÷W×n
（2）按照蛋白质含量计算
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性（U/mg prot）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(2×y2÷Cpr×n)-(0.4×y1÷Cpr×n)
=(2×y2-0.4×y1)÷Cpr×n
（3）按液体样本体积计算
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(U/L)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(2×y2×n)-(0.4×y1×n)=(2×y2-0.4×y1)×n
V反总：反应体系总体积，0.15mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.075 mL；W：样本质量，g；V样总：样本总体积，10mL；T：反应时间，5min； n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；5：总淀粉酶稀释倍数。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
