产品简介
淀粉酶负责水解淀粉,主要包括α-淀粉酶(α-AL)和β-淀粉酶(β-AL,EC 3.2.1.2)。β-淀粉酶从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中β-淀粉酶活性。其原理是淀粉酶催化淀粉水解生成还原糖,还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质,在540nm有吸收峰;通过测定540nm吸光度增加速率,计算淀粉酶活性。α-淀粉酶耐热,但是β-淀粉酶在70℃下15 min可钝化。因此粗酶液经过70℃钝化15 min,就只有α-淀粉酶能够催化淀粉水解。用不钝化的粗酶液测出总淀粉酶活性,减去α-淀粉酶就可得到β-淀粉酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
DNS试剂 | 35mL | 70mL | 室温避光保存。 |
底物 | 1 | 1 | 4℃ |
标准品 | 1 | 1 | 4℃ |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测540nm处的吸光度)
水浴锅、离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
DNS 试剂:即用型;使用前,平衡到室温;室温避光保存(若有黄色晶体析出,需加热到90℃溶解)。
底物:临用前96T加入 35mL去离子水,48T加入 17.5mL去离子水,上下颠倒摇晃几次,加热至溶解。溶解后的底物 4℃保存,若有沉淀析出,可70℃加热溶解后使用。
标准品:含10 mg无水葡萄糖,临用前加入1mL去离子水溶解得10 mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或-20℃长期保存。
标准曲线设置:按下表所示,用去离子水将10mg/mL标准品稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mg/mL 的标准溶液。
标准品体积(µL) | 去离子水体积(µL) | 标准品浓度(mg/mL) | |
标准品1 | 40µL 10mg/mL | 360 | 1 |
标准品2 | 200µL of 标准品1 (1mg/mL) | 200 | 0.5 |
标准品3 | 200µL of 标准品2 (0.5mg/mL) | 200 | 0.25 |
标准品4 | 200µL of 标准品3 (0.25mg/mL) | 200 | 0.125 |
标准品5 | 200µL of 标准品4 (0.125mg/mL) | 200 | 0.0625 |
标准品6 | 200µL of 标准品5 (0.0625mg/mL) | 200 | 0.0313 |
标准品7 | 200µL of 标准品6 (0.0313mg/mL) | 200 | 0.0156 |
注意:每次实验,请使用新配制的标准品。
样本制备
1. 动物组织:称取约0.1g样本,加入1mL去离子水匀浆,将匀浆倒入离心管中,在室温下放置15min,每隔5min振荡1次,使其充分提取。6,000g,室温离心10min,吸取上清液并且加去离子水定容至10mL,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL,加入4mL去离子水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。
2. 植物组织,称取约0.1g样本,加入1mL去离子水捣碎,超声波破碎 5min(功率20%,超声3s,间隔7s,重复30次),在室温下放置15min,每隔5min 振荡1次,使其充分提取。6,000g,室温离心10min,吸取上清液并且加去离子水定容至10mL,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL,加入4mL去离子水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。
3. 血清(浆)和唾液等液体样本:直接测定,建议预实验确定合适的稀释倍数,适当稀释的液体样本即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL,加入4mL蒸馏水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存6个月。对于脂肪含量较高的动物组织,离心后移除上层脂肪,再取上清液。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上,调节波长到540nm,可见光分光光度计去离子水调零;水浴锅预热到70℃。
2. 每个样本取2支EP管分别加入75μL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液,沸水浴5min,分别作为α-淀粉酶对照管和总淀粉酶对照管使用。
3. 样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):
标准曲线的测定 | α-淀粉酶活力测定 | 总淀粉酶活力测定 | ||||
标准管 (μL) | 空白管 (μL) | 测定管 (μL) | 对照管 (μL) | 测定管 (μL) | 对照管 (μL) | |
不同浓度标准品 | 75 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
去离子水 | 0 | 75 | 0 | 0 | 0 | 0 |
淀粉酶原液 | 0 | 0 | 75 | 75(煮沸原液) | 0 | 0 |
70℃水浴15min,冷却 | ||||||
淀粉酶稀释液 | 0 | 0 | 0 | 0 | 75 | 75(煮沸稀释液) |
底物 | 0 | 0 | 75 | 0 | 75 | 0 |
去离子水 | 75 | 75 | 0 | 0 | 0 | 0 |
40℃恒温水浴中保温5min | ||||||
DNS试剂 | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 | 150 |
底物 | 0 | 0 | 0 | 75 | 0 | 75 |
4. 混匀,沸水浴5min,冷却,取200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中,测定540nm处的吸光值,计算ΔA α=A测定α-A对照α;ΔA总=A测定总-A对照总;ΔA标准=A标准-A空白。
注意:每个样本需分别设置α-淀粉酶活力测定对照和总淀粉酶活力测定对照,空白管只需做1管。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本A测定大于2,则说明样本酶活力太高,必须用去离子水稀释成适当浓度(计算公式中乘以相应稀释倍数)。若样本ΔA测定小于0.005可以重新提取样本减少去离子水定容的体积。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴,ΔA标准为x轴,绘制标准曲线。将ΔA α带入方程得到y1值(mg/mL),ΔA总带入方程得到y2值(mg/mL)。
2. α-淀粉酶活性计算
(1)按样本质量计算
单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶活性(U/g 质量)=y1×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×n=4×y1÷W×n
(2)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶活性(U/mg prot)=y1×V反总÷(Cpr×V样)÷T×n=0.4×y1÷Cpr×n
(3)按液体样本体积计算
单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1 mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶活性(U/mL)=y1×V反总÷V样÷T×n=0.4×y1×n
3. 总淀粉酶活性计算:
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性 (U/g 质量)=5×y2×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×n=20×y2÷W×n
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×y2×V反总÷(V样×Cpr)÷T×n=2×y2÷Cpr×n
(3)按液体样本体积计算
单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(U/L)=5×y2×V反总÷V样÷T×n=2×y2×n
4. β-淀粉酶活性计算:
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(U/g 质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(20×y2÷W×n)-(4×y1÷W×n)
=(20×y2-4×y1)÷W×n
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(2×y2÷Cpr×n)-(0.4×y1÷Cpr×n)
=(2×y2-0.4×y1)÷Cpr×n
(3)按液体样本体积计算
单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(U/L)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(2×y2×n)-(0.4×y1×n)=(2×y2-0.4×y1)×n
V反总:反应体系总体积,0.15mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.075 mL;W:样本质量,g;V样总:样本总体积,10mL;T:反应时间,5min; n:样本稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;5:总淀粉酶稀释倍数。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。