淀粉系列

β-淀粉酶检测试剂盒(微量法)

货号:PMK1156
规格:48T/96T
价格:600元/1000元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

淀粉酶负责水解淀粉,主要包括α-淀粉酶(α-AL)和β-淀粉酶(β-AL,EC 3.2.1.2)。β-淀粉酶从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中β-淀粉酶活性其原理是淀粉酶催化淀粉水解生成还原糖,还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质,在540nm有吸收峰;通过测定540nm吸光度增加速率,计算淀粉酶活性。α-淀粉酶耐热,但是β-淀粉酶在70℃下15 min可钝化。因此粗酶液经过70℃钝化15 min,就只有α-淀粉酶能够催化淀粉水解。用不钝化的粗酶液测出总淀粉酶活性,减去α-淀粉酶就可得到β-淀粉酶活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

DNS试剂

35mL

70mL

室温避光保存。

底物

1

1

4℃

标准品

1

1

4℃

自备耗材

酶标仪或可见光分光光度计(能测540nm处的吸光度)

水浴锅、离心机

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

DNS 试剂:即用型;使用前,平衡到室温;室温避光保存(若有黄色晶体析出,需加热到90℃溶解)。

底物:临用前96T加入 35mL去离子水,48T加入 17.5mL去离子水上下颠倒摇晃几次,加热至溶解。溶解后的底物 4℃保存,若有沉淀析出,可70℃加热溶解后使用。

标准品:含10 mg无水葡萄糖,临用前加入1mL去离子水溶解得10 mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或-20℃长期保存。

标准曲线设置:按下表所示,用去离子水将10mg/mL标准品稀释为10.50.250.1250.06250.03130.0156 mg/mL 的标准溶液。


标准品体积(µL

去离子水体积(µL

标准品浓度(mg/mL

标准品1

40µL 10mg/mL

360

1

标准品2

200µL of 标准品1 (1mg/mL)

200

0.5

标准品3

200µL of 标准品2 (0.5mg/mL)

200

0.25

标准品4

200µL of 标准品3 (0.25mg/mL)

200

0.125

标准品5

200µL of 标准品4 (0.125mg/mL)

200

0.0625

标准品6

200µL of 标准品5 (0.0625mg/mL)

200

0.0313

标准品7

200µL of 标准品6 (0.0313mg/mL)

200

0.0156

注意:每次实验,请使用新配制的标准品

样本制备

1. 动物组织:称取约0.1g样本,加入1mL去离子水匀浆,将匀浆倒入离心管中,在室温下放置15min,每隔5min振荡1次,使其充分提取。6,000g,室温离心10min,吸取上清液并且加去离子水定容至10mL,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL,加入4mL去离子水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。

2. 植物组织,称取约0.1g样本,加入1mL去离子水捣碎,超声波破碎 5min(功率20%,超声3s,间隔7s,重复30次),在室温下放置15min,每隔5min 振荡1次,使其充分提取。6,000g,室温离心10min,吸取上清液并且加去离子水定容至10mL,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL,加入4mL去离子水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。

3. 血清(浆)和唾液等液体样本:直接测定,建议预实验确定合适的稀释倍数,适当稀释的液体样本即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1mL,加入4mL蒸馏水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存6个月。对于脂肪含量较高的动物组织,离心后移除上层脂肪,再取上清液。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上,调节波长到540nm,可见光分光光度计去离子水调零;水浴锅预热到70℃。

2. 每个样本取2支EP管分别加入75μL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液,沸水浴5min,分别作为α-淀粉酶对照管和总淀粉酶对照管使用。

3. 样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):


标准曲线的测定

α-淀粉酶活力测定

总淀粉酶活力测定

标准管

μL)

空白管

μL)

测定管

μL)

对照管

μL)

测定管

μL)

对照管

μL)

不同浓度标准品

75

0

0

0

0

0

去离子水

0

75

0

0

0

0

淀粉酶原液

0

0

75

75(煮沸原液)

0

0

70℃水浴15min,冷却

淀粉酶稀释液

0

0

0

0

75

75(煮沸稀释液)

底物

0

0

75

0

75

0

去离子水

75

75

0

0

0

0

40℃恒温水浴中保温5min

DNS试剂

150

150

150

150

150

150

底物

0

0

0

75

0

75

4. 混匀,沸水浴5min,冷却,取200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中,测定540nm处的吸光值,计算ΔA α=A测定α-A对照αΔA=A测定-A对照ΔA标准=A标准-A空白

注意:每个样本需分别设置α-淀粉酶活力测定对照和总淀粉酶活力测定对照,空白管只需做1管。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本A测定大于2,则说明样本酶活力太高,必须用去离子水稀释成适当浓度(计算公式中乘以相应稀释倍数)。若样本ΔA测定小于0.005可以重新提取样本减少去离子水定容的体积。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准液浓度为y轴,ΔA标准x轴,绘制标准曲线。将ΔA α带入方程得到y1值(mg/mL),ΔA带入方程得到y2值(mg/mL)。

2. α-淀粉酶活性计算

1)按样本质量计算

单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

 α-淀粉酶活性(U/g 质量)=y1×V反总÷(W×V÷V样总)÷T×n=4×y1÷W×n  

2)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

 α-淀粉酶活性U/mg prot)=y1×V反总÷(Cpr×V÷T×n=0.4×y1÷Cpr×n  

3)按液体样本体积计算

单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1 mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/mL)=y1×V反总÷V÷T×n=0.4×y1×n

3. 总淀粉酶活性计算:

1)按照样本质量计算

单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性 (U/g 质量)=5×y2×V反总÷(W×V÷V样总)÷T×n=20×y2÷W×n 

2)按照蛋白质含量计算

单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×y2×V反总÷(V×Cpr)÷T×n=2×y2÷Cpr×n 

3)按液体样本体积计算

单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/L)=5×y2×V反总÷V÷T×n=2×y2×n

4. β-淀粉酶活性计算:

1)按照样本质量计算

单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/g 质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(20×y2÷W×n)-(4×y1÷W×n)

=(20×y2-4×y1)÷W×n

2)按照蛋白质含量计算

单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(2×y2÷Cpr×n)-(0.4×y1÷Cpr×n)

=(2×y2-0.4×y1)÷Cpr×n

3)按液体样本体积计算

单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/L)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(2×y2×n)-(0.4×y1×n)=(2×y2-0.4×y1)×n

V反总:反应体系总体积0.15mL;V:加入反应体系中样本体积,0.075 mL;W:样本质量,g;V样总:样本总体积,10mL;T:反应时间,5min; n:样本稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;5:总淀粉酶稀释倍数。

结果展示

典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。


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