产品简介：
淀粉分支酶（SBE）（EC 2.4.1.18）主要存在于植物中，是参与支链淀粉合成的关键酶，催化直链淀粉变为支链淀粉。测定淀粉分支酶（SBE）活性在淀粉生物合成、优质农作物品种选育和品质遗传改良研究中具有重要意义。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测植物组织、细菌等样本中SBE活性，其原理是：直链淀粉和碘结合后在660nm有特征光吸收，SBE使直链淀粉含量减少，从而降低了淀粉-碘复合物在660nm吸收值，一定时间内吸光度下降的百分率可以反映SBE活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
反应缓冲液 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
底物 | 1 | 1 | 4℃保存 |
显色物 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测660 nm处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
底物：临用前96T加入6mL去离子水，48T加入3mL上下颠倒摇晃几次，加热至溶解。溶解后的底物 4℃保存，若有沉淀析出，可70℃加热溶解后使用。
显色物：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
样本制备
1．植物组织：称取约0.1g 组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。15,000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
2．细菌：收集500万细菌到离心管内，用冷PBS清洗细菌，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），15,000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm；可见分光光度计去离子水调零。恒温箱预热到37℃。
2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
对照管（μL） | 测定管（μL） | |
煮沸1min后灭活的样本 | 65 | 0 |
样本 | 0 | 65 |
反应缓冲液 | 85 | 85 |
底物 | 25 | 25 |
混匀，37℃准确保温20min，置沸水浴中5min终止反应（盖紧防止水分散失），冷却 | ||
去离子水 | 115 | 115 |
显色物 | 10 | 10 |
3. 混匀，即刻取 200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中，660nm处读取各管吸光值，分别记为A对照，A测定。
注意：每个测定管需设个一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行煮沸1min处理。底物使用中如有沉淀，务必70℃浴溶解后使用。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按照样本质量计算
单位的定义：以波长660nm的吸光度下降百分率表示，每g组织在反应体系中每分钟降低0.5%碘蓝值为一个酶活性单位。
SBE 活性(U/g质量) =(A对照-A测定)÷A对照×V反总×100%÷0.5%÷(W×V样÷V提取)÷T
=46.15×(A对照-A测定)÷A对照÷W
2. 按照蛋白浓度计算
单位的定义：以波长660nm的吸光度下降百分率表示，每mg蛋白在反应体系中每分钟降低0.5%碘蓝值为一个酶活性单位。
SBE 活性(U/mg prot) =(A对照-A测定)÷A对照×V反总×100%÷0.5%÷(Cpr×V样)÷T
=46.15×(A对照-A测定)÷A对照÷Cpr
3. 按细菌细胞数量计算
单位的定义：以波长660nm的吸光度下降百分率表示，每104个细菌在反应体系中每分钟降低0.5%碘蓝值为一个酶活性单位。
SBE活性(U/104) =(A对照-A测定)÷A对照×V反总×100%÷0.5%÷(细菌数量×V样÷V提取)÷T
=46.15×(A对照-A测定)÷A对照÷500=0.092×(A对照-A测定)÷A对照
B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式
1. 按照样本质量计算
单位的定义：以波长660nm的吸光度下降百分率表示，每g组织在反应体系中每分钟降低1%碘蓝值为一个酶活性单位。
SBE 活性(U/g 质量) =(A对照-A测定)÷A对照×V反总×100%÷1%÷(W×V样÷V提取)÷T=23.08×(A对照-A测定)÷A对照÷W
2. 按照蛋白浓度计算
单位的定义：以波长660nm的吸光度下降百分率表示，每mg蛋白在反应体系中每分钟降低1%碘蓝值为一个酶活性单位。
SBE 活性(U/mg prot) =(A对照-A测定)÷A对照×V反总×100%÷1%÷(Cpr×V样)÷T=23.08×(A对照-A测定)÷A对照÷Cpr
3. 按细菌细胞数量计算
单位的定义：以波长660nm的吸光度下降百分率表示，每104个细菌在反应体系中每分钟降低1%碘蓝值为一个酶活性单位。
SBE活性(U/104) =(A对照-A测定)÷A对照×V反总×100%÷1%÷(细菌数量×V样÷V提取)÷T
=23.08×(A对照-A测定)÷A对照÷500=0.046×(A对照-A测定)÷A对照
V反总：反应体系体积，0.3mL；W：样本质量，g；V提取：加入提取液体积，1mL；V样：加入样本体积，0.065mL；T：反应时间，20min；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；500：细菌数量，500万。
