氧化磷酸化系列

线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶检测试剂盒(微量法)

货号:PMK1104
规格:48T/96T
价格:1560元/2600元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

线粒体呼吸链复合体Ⅴ,又称 F1F0-ATP合酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成,也可逆过程水解ATP。此外,线粒体呼吸链复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。线粒体呼吸链复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。试剂盒提供了一种简单的检测方法,用于检测生物体内线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性,其原理是线粒体呼吸链复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi,通过测定Pi增加速率来测定线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

试剂一

50mL

100mL

4℃保存

试剂二

40mL

80mL

4℃保存

试剂三

1mL

2mL

4℃避光保存

试剂四

1

1

-20℃避光保存

试剂五

4mL

8mL

4℃保存

试剂六

1

1

4℃避光保存

试剂七

1

1

4℃避光保存

试剂八

1

1

4℃避光保存

试剂九

5mL

10mL

室温保存

标准品

1mL

1mL

4℃避光保存

自备耗材

酶标仪或分光光度计(能测660nm处的吸光度)及恒温箱

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

制冰机、低温离心机

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。

试剂四:临用前配制,48T加入1mL去离子水充分溶解,96 T加入2mL去离子水充分溶解。未用完的试剂需分装后-20℃保存,避免反复冻融。

试剂五:即用型;使用前,平衡到室温;4保存。

试剂六:临用前配制,48T加入2mL去离子水充分溶解,96T加入4mL去离子水充分溶解后使用。

试剂七:临用前配制,48 T加入5mL去离子水充分溶解,96T加入10mL去离子水充分溶解后使用。

试剂八:临用前配制,48 T加入5mL去离子水充分溶解,96 T加入10mL去离子水充分溶解后使用。

试剂九:即用型;室温保存。

定磷试剂的配制:配制比例按照H2O : 试剂七 : 试剂八 : 试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。

注意:配试剂最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

标准曲线设置按下表所示用去离子水将10mM 标准品稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM 的标准溶液。


标准品体积(µL)

去离子水体积(µL)

标准品浓度(mM)

Std.1

100µL 10mM

900

1

Std.2

100µL of Std.1 (1mM)

100

0.5

Std.3

100µL of Std.2 (0.5mM)

100

0.25

Std.4

100µL of Std.3 (0.25mM)

100

0.125

Std.5

100µL of Std.4 (0.125mM)

100

0.0625

Std.6

100µL of Std.5 (0.0625mM)

100

0.0313

Std.7

100µL of Std.6 (0.0313mM)

100

0.0156

样本制备

注意:推荐使用新鲜样本,以保证酶的活力。

线粒体呼吸链复合体Ⅴ的提取:

1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞,加入1mL试剂一10µL试剂三,冰浴匀浆;

2. 离心匀浆液,600g, 5min, 4℃,收集上清液至另一新的离心管中,舍弃沉淀;

3. 再次离心上清,11,000g, 10min, 4℃,沉淀即为提取的线粒体,用作第5步操作;

4. (选做)上清液即为胞浆提取物,可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅴ(此步可选做,可用于判断线粒体提取效果);

5. 在沉淀中加入800µL 试剂二8µL 试剂三,充分重悬沉淀,用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅴ酶活性检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到660nm可见分光光度计去离子水调零。

2. 酶促反应(在EP管中依次加入下列试剂):


空白管(μL)

标准管(μL)

测定管(μL)

对照管(μL)

试剂四

0

0

10

10

试剂五

0

0

40

40

样本

0

0

50

0

混匀后盖紧,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确孵育30min

试剂六

0

0

20

20

样本

0

0

0

50

混匀后,室温(25左右),4,000g,离心10min,取上清液;

3. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂)

上清

0

0

40

40

不同浓度标准品

0

40

0

0

去离子水

40

0

0

0

定磷试剂

200

200

200

200

混匀,室温静置10min后,测定660nm吸光值。计算ΔA=A测定-A对照ΔA=A标准-A空白。(空白管只需做 1 管)

4. 注意:为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于1.5)可用试剂二稀释样本后再测定,计算结果时注意乘以稀释倍数。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准液浓度为y轴,ΔAx轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。

2. 无机磷(Pi)含量的计算

∆A带入方程得到y值(mM)。

3. 线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性计算

1)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位

上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:

复合体Ⅴ上清活性(U/g 鲜重)= (y上清×V酶促×106)÷(V÷V提取×W)÷T=80.8×y上清÷W

沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:

复合体Ⅴ沉淀活性(U/g 鲜重)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V÷V重悬×W)÷T=64.64×y沉淀÷W

样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性的计算:

样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性之和。

按样本鲜重计算:线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性(U/g 鲜重)=80.8×y上清÷W+ 64.64×y沉淀÷W

2) 按细胞数量计算

单位的定义:每1万个细胞每分钟产生1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位

上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:

复合体Ⅴ上清活性(U/104 cell)= (y上清×V酶促×106)÷(V÷V提取×500)÷T=0.162×y上清

沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:

复合体沉淀活性(U/104 cell)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V÷V重悬×500)÷T=0.129×y沉淀

样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性的计算:

样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性之和。

按细胞数量计算:线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性(U/104 cell)=0.162×y上清+0.129×y沉淀

V酶促:酶促反应体系总体积,1.2×10-4L;106:单位换算系数,1mmol=106nmol;V:加入样本体积,0.05mL;T:反应时间,30min;V提取:提取体系体积,1.01mL ;W:样本重量,g;V重悬:重悬沉淀体积,0.808mL;500:细胞总数,500万。


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