产品简介
线粒体呼吸链复合体Ⅴ，又称 F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，线粒体呼吸链复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。线粒体呼吸链复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物体内线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性，其原理是线粒体呼吸链复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 40mL | 80mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
试剂五 | 4mL | 8mL | 4℃保存 |
试剂六 | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
试剂七 | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
试剂八 | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
试剂九 | 5mL | 10mL | 室温保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计（能测660nm处的吸光度）及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂四：临用前配制，48T加入1mL去离子水充分溶解，96 T加入2mL去离子水充分溶解。未用完的试剂需分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂五：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂六：临用前配制，48T加入2mL去离子水充分溶解，96T加入4mL去离子水充分溶解后使用。
试剂七：临用前配制，48 T加入5mL去离子水充分溶解，96T加入10mL去离子水充分溶解后使用。
试剂八：临用前配制，48 T加入5mL去离子水充分溶解，96 T加入10mL去离子水充分溶解后使用。
试剂九：即用型；室温保存。
定磷试剂的配制：配制比例按照H2O : 试剂七 : 试剂八 : 试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
标准曲线设置：按下表所示用去离子水将10mM 标准品稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM 的标准溶液。
标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（mM） | |
Std.1 | 100µL 10mM | 900 | 1 |
Std.2 | 100µL of Std.1 (1mM) | 100 | 0.5 |
Std.3 | 100µL of Std.2 (0.5mM) | 100 | 0.25 |
Std.4 | 100µL of Std.3 (0.25mM) | 100 | 0.125 |
Std.5 | 100µL of Std.4 (0.125mM) | 100 | 0.0625 |
Std.6 | 100µL of Std.5 (0.0625mM) | 100 | 0.0313 |
Std.7 | 100µL of Std.6 (0.0313mM) | 100 | 0.0156 |
样本制备
注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。
线粒体呼吸链复合体Ⅴ的提取：
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mL试剂一和10µL试剂三，冰浴匀浆；
2. 离心匀浆液，600g, 5min, 4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；
3. 再次离心上清，11,000g, 10min, 4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；
4. (选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅴ（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）；
5. 在沉淀中加入800µL 试剂二和8µL 试剂三，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅴ酶活性检测。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 酶促反应（在EP管中依次加入下列试剂）：
空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） | 对照管（μL） | |
试剂四 | 0 | 0 | 10 | 10 |
试剂五 | 0 | 0 | 40 | 40 |
样本 | 0 | 0 | 50 | 0 |
混匀后盖紧，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确孵育30min | ||||
试剂六 | 0 | 0 | 20 | 20 |
样本 | 0 | 0 | 0 | 50 |
混匀后，室温（25℃左右），4,000g，离心10min，取上清液； | ||||
3. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂） | ||||
上清 | 0 | 0 | 40 | 40 |
不同浓度标准品 | 0 | 40 | 0 | 0 |
去离子水 | 40 | 0 | 0 | 0 |
定磷试剂 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀，室温静置10min后，测定660nm吸光值。计算ΔA测=A测定-A对照，ΔA标=A标准-A空白。（空白管只需做 1 管） | ||||
4. 注意：为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5）可用试剂二稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
2. 无机磷（Pi）含量的计算
将∆A测带入方程得到y值（mM）。
3. 线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性计算
（1）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位
上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算：
复合体Ⅴ上清活性(U/g 鲜重)= (y上清×V酶促×106)÷(V样÷V提取×W)÷T=80.8×y上清÷W
沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:
复合体Ⅴ沉淀活性(U/g 鲜重)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V样÷V重悬×W)÷T=64.64×y沉淀÷W
样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性的计算：
样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性之和。
按样本鲜重计算：线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性（U/g 鲜重）=80.8×y上清÷W+ 64.64×y沉淀÷W
（2） 按细胞数量计算
单位的定义：每1万个细胞每分钟产生1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位
上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算：
复合体Ⅴ上清活性(U/104 cell)= (y上清×V酶促×106)÷(V样÷V提取×500)÷T=0.162×y上清
沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:
复合体Ⅴ沉淀活性(U/104 cell)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V样÷V重悬×500)÷T=0.129×y沉淀
样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性的计算：
样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性之和。
按细胞数量计算：线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性（U/104 cell）=0.162×y上清+0.129×y沉淀
V酶促：酶促反应体系总体积，1.2×10-4L；106：单位换算系数，1mmol=106nmol；V样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，30min；V提取：提取体系体积，1.01mL ；W：样本重量，g；V重悬：重悬沉淀体积，0.808mL；500：细胞总数，500万。
