产品简介
线粒体呼吸链复合体Ⅴ,又称 F1F0-ATP合酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成,也可逆过程水解ATP。此外,线粒体呼吸链复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。线粒体呼吸链复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。本试剂盒提供了一种简单的检测方法,用于检测生物体内线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性,其原理是线粒体呼吸链复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi,通过测定Pi增加速率来测定线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 40mL | 80mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
试剂五 | 4mL | 8mL | 4℃保存 |
试剂六 | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
试剂七 | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
试剂八 | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
试剂九 | 5mL | 10mL | 室温保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计(能测660nm处的吸光度)及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂四:临用前配制,48T加入1mL去离子水充分溶解,96 T加入2mL去离子水充分溶解。未用完的试剂需分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂五:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂六:临用前配制,48T加入2mL去离子水充分溶解,96T加入4mL去离子水充分溶解后使用。
试剂七:临用前配制,48 T加入5mL去离子水充分溶解,96T加入10mL去离子水充分溶解后使用。
试剂八:临用前配制,48 T加入5mL去离子水充分溶解,96 T加入10mL去离子水充分溶解后使用。
试剂九:即用型;室温保存。
定磷试剂的配制:配制比例按照H2O : 试剂七 : 试剂八 : 试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。
注意:配试剂最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。
标准曲线设置:按下表所示用去离子水将10mM 标准品稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM 的标准溶液。
标准品体积(µL) | 去离子水体积(µL) | 标准品浓度(mM) | |
Std.1 | 100µL 10mM | 900 | 1 |
Std.2 | 100µL of Std.1 (1mM) | 100 | 0.5 |
Std.3 | 100µL of Std.2 (0.5mM) | 100 | 0.25 |
Std.4 | 100µL of Std.3 (0.25mM) | 100 | 0.125 |
Std.5 | 100µL of Std.4 (0.125mM) | 100 | 0.0625 |
Std.6 | 100µL of Std.5 (0.0625mM) | 100 | 0.0313 |
Std.7 | 100µL of Std.6 (0.0313mM) | 100 | 0.0156 |
样本制备
注意:推荐使用新鲜样本,以保证酶的活力。
线粒体呼吸链复合体Ⅴ的提取:
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞,加入1mL试剂一和10µL试剂三,冰浴匀浆;
2. 离心匀浆液,600g, 5min, 4℃,收集上清液至另一新的离心管中,舍弃沉淀;
3. 再次离心上清,11,000g, 10min, 4℃,沉淀即为提取的线粒体,用作第5步操作;
4. (选做)上清液即为胞浆提取物,可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅴ(此步可选做,可用于判断线粒体提取效果);
5. 在沉淀中加入800µL 试剂二和8µL 试剂三,充分重悬沉淀,用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅴ酶活性检测。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到660nm,可见分光光度计去离子水调零。
2. 酶促反应(在EP管中依次加入下列试剂):
空白管(μL) | 标准管(μL) | 测定管(μL) | 对照管(μL) | |
试剂四 | 0 | 0 | 10 | 10 |
试剂五 | 0 | 0 | 40 | 40 |
样本 | 0 | 0 | 50 | 0 |
混匀后盖紧,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确孵育30min | ||||
试剂六 | 0 | 0 | 20 | 20 |
样本 | 0 | 0 | 0 | 50 |
混匀后,室温(25℃左右),4,000g,离心10min,取上清液; | ||||
3. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂) | ||||
上清 | 0 | 0 | 40 | 40 |
不同浓度标准品 | 0 | 40 | 0 | 0 |
去离子水 | 40 | 0 | 0 | 0 |
定磷试剂 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀,室温静置10min后,测定660nm吸光值。计算ΔA测=A测定-A对照,ΔA标=A标准-A空白。(空白管只需做 1 管) |
4. 注意:为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于1.5)可用试剂二稀释样本后再测定,计算结果时注意乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴,ΔA标为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。
2. 无机磷(Pi)含量的计算
将∆A测带入方程得到y值(mM)。
3. 线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性计算
(1)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位
上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:
复合体Ⅴ上清活性(U/g 鲜重)= (y上清×V酶促×106)÷(V样÷V提取×W)÷T=80.8×y上清÷W
沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:
复合体Ⅴ沉淀活性(U/g 鲜重)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V样÷V重悬×W)÷T=64.64×y沉淀÷W
样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性的计算:
样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性之和。
按样本鲜重计算:线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性(U/g 鲜重)=80.8×y上清÷W+ 64.64×y沉淀÷W
(2) 按细胞数量计算
单位的定义:每1万个细胞每分钟产生1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位
上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:
复合体Ⅴ上清活性(U/104 cell)= (y上清×V酶促×106)÷(V样÷V提取×500)÷T=0.162×y上清
沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算:
复合体Ⅴ沉淀活性(U/104 cell)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V样÷V重悬×500)÷T=0.129×y沉淀
样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性的计算:
样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性之和。
按细胞数量计算:线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性(U/104 cell)=0.162×y上清+0.129×y沉淀
V酶促:酶促反应体系总体积,1.2×10-4L;106:单位换算系数,1mmol=106nmol;V样:加入样本体积,0.05mL;T:反应时间,30min;V提取:提取体系体积,1.01mL ;W:样本重量,g;V重悬:重悬沉淀体积,0.808mL;500:细胞总数,500万。