产品简介
乙酰辅酶A (Acetyl-CoA) 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化,经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水,释放能量用于ATP合成。此外,乙酰辅酶A是合成脂肪酸,酮体,胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。本试剂盒提供了一种简单、灵敏、快速的乙酰辅酶A检测方法,其检测原理是苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应,乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比,NADH在340nm处有特征吸收峰,通过检测340nm吸光值的计算既可得到乙酰辅酶A含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
试剂二 | 5μL | 10μL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
试剂四 | 15mL | 30mL | 4℃保存 |
标准品(NADH) | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机,低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:临用前配制,对于48T,加入125μL 试剂四 充分溶解备用;对于96T,加入250μL 试剂四 充分溶解备用,未用完的试剂-20℃分装保存。
试剂二:临用前配制,对于48T,加入125μL 试剂四 充分混匀备用;对于96T,加入250μL 试剂四 充分溶解备用,未用完的试剂4℃分装保存。
试剂三:临用前配制,对于48T,加入11.3mL试剂四充分溶解备用;对于96T,加入22.5mL 试剂四 充分溶解备用,未用完的试剂-20℃分装保存。
工作液:临用前请根据样本数配制,计算工作液体积(样本数×0.23 mL),将试剂一、试剂二和试剂三按照1:1:90的比例混合,或者直接把试剂一和试剂二加入到试剂三混匀(可以测定48样或96样)。
标准品(NADH):临用前配制,对于48T,加入0.5mL去离子水充分溶解备用;对于96T,加入1mL去离子水充分溶解备用,得8,000nmol/mL标准品,未用完的试剂-20℃分装保存。
标准曲线设置:按照如下表格,用去离子水将8,000 nmol/mL标准品稀释为3,200、1,600、800、400、200、100、50、0 nmol/mL的标准溶液。
标准液体积 | 去离子水体积(µL) | 浓度(nmol/mL) | |
Std.1 | 100 µL 8,000 nmol/mL | 150 | 3,200 |
Std.2 | 100 µL of Std.1 (3,200 nmol/mL) | 100 | 1,600 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (1,600 nmol/mL) | 100 | 800 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (800 nmol/mL) | 100 | 400 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (400 nmol/mL) | 100 | 200 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (200 nmol/mL) | 100 | 100 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (100 nmol/mL) | 100 | 50 |
Std.8 | 0 | 200 | 0 |
注意:Std.8即空白孔。
样本制备
细胞样本:收集500万细胞到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后13,000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织样本:称取0.1 g组织,加入 1mL提取液,冰浴匀浆,然后13,000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
注意:建议使用新鲜样本。如果不立即使用,可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm,紫外分光光度计去离子水调零。
2. 工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育10min。
3.测定:在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中,按照下表进行实验
测定孔(μL) | 标准孔(μL) | |
样本 | 25 | 0 |
不同浓度的标准品 | 0 | 25 |
工作液 | 230 | 230 |
混匀,测定孔读取340nm处20秒的吸光值A1和1分20秒时的吸光值A2,计算ΔA测=A2-A1,标准孔读取340 nm处1分20秒时的吸光值A标准,ΔA标=A标准-A空白。
注意:实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.5,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以ΔA标为x轴,标准品浓度为y轴,制作标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果),得到方程,将ΔA测定带入方程,得到y值。
2.乙酰辅酶A含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算:
乙酰辅酶A含量(nmol/mg prot)=(y×V样)÷(V样×Cpr)×n=y÷Cpr×n
(2)按样本鲜重计算:
乙酰辅酶A含量(nmol/g 鲜重)=(y×V样)÷(W×V样÷V提取)×n=y÷W×n
(3)按细胞密度计算:
乙酰辅酶A含量(nmol/104 cells)=(y×V样)÷(500×V样÷V提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n
V样:加入样本体积,0.025mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g;V提取:加入提取液体积,1 mL;500:细胞或细菌总数,500万;n:样本稀释倍数。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。