三羧酸循环系列

乙酰辅酶A检测试剂盒(微量法)

货号:PMK1112
规格:48T/96T
价格:3450元/5900元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

乙酰辅酶A (Acetyl-CoA) 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化,经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水,释放能量用于ATP合成。此外,乙酰辅酶A是合成脂肪酸,酮体,胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。试剂盒提供了一种简单、灵敏、快速的乙酰辅酶A检测方法,其检测原理是苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应,乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比,NADH在340nm处有特征吸收峰,通过检测340nm吸光值的计算既可得到乙酰辅酶A含量。

 

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T


提取液

50mL

100mL

4℃保存

试剂一

1

1

-20℃避光保存

试剂二

5μL

10μL

4℃避光保存

试剂三

1

1

-20℃避光保存

试剂四

15mL

30mL

4℃保存

标准品NADH)

1

1

-20℃避光保存

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)

96孔UV微孔或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

水浴锅制冰机,低温离心机

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂一:临用前配制,对于48T,加入125μL 试剂四 充分溶解备用;对于96T,加入250μL 试剂四 充分溶解备用,未用完的试剂-20℃分装保存。

试剂二:临用前配制,对于48T,加入125μL 试剂四 充分混匀备用;对于96T,加入250μL 试剂四 充分溶解备用,未用完的试剂4℃分装保存。

试剂三:临用前配制,对于48T,加入11.3mL试剂四充分溶解备用;对于96T,加入22.5mL 试剂四 充分溶解备用,未用完的试剂-20℃分装保存。

工作液:临用前请根据样本数配制,计算工作液体积(样本数×0.23 mL),将试剂一试剂二试剂三按照1:1:90的比例混合,或者直接把试剂一试剂二加入到试剂三混匀(可以测定48样或96样)。

标准品NADH):临用前配制,对于48T,加入0.5mL去离子水充分溶解备用;对于96T,加入1mL去离子水充分溶解备用,得8,000nmol/mL标准品,未用完的试剂-20℃分装保存。

标准曲线设置:按照如下表格,用去离子水将8,000 nmol/mL标准品稀释为3,200、1,600、800、400、200、100、50、0 nmol/mL的标准溶液。


标准液体积

去离子水体积(µL)

浓度(nmol/mL)

Std.1

100 µL 8,000 nmol/mL

150

3,200

Std.2

100 µL of Std.1 (3,200 nmol/mL)

100

1,600

Std.3

100 µL of Std.2 (1,600 nmol/mL)

100

800

Std.4

100 µL of Std.3 (800 nmol/mL)

100

400

Std.5

100 µL of Std.4 (400 nmol/mL)

100

200

Std.6

100 µL of Std.5 (200 nmol/mL)

100

100

Std.7

100 µL of Std.6 (100 nmol/mL)

100

50

Std.8

0

200

0

 

注意Std.8即空白孔。

样本制备

细胞样本:收集500万细胞到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后13,000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织样本:称取0.1 g组织,加入 1mL提取液,冰浴匀浆,然后13,000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

注意:建议使用新鲜样本。如果不立即使用,可将样品在-80下保存一个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

 

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm,紫外分光光度计去离子水调零。

2. 工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育10min。

3.测定:在96孔UV微孔或微量石英比色皿中,按照下表进行实验


测定孔(μL)

标准孔(μL)

样本

25

0

不同浓度的标准品

0

25

工作液

230

230

混匀,测定孔读取340nm处20秒的吸光值A11分20秒时的吸光值A2计算ΔA=A2-A1,标准孔读取340 nm处1分20秒时的吸光值A标准ΔA=A标准-A空白

注意:实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA大于1.5,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。

 

结果计算

1. 标准曲线的绘制

ΔAx轴,标准品浓度为y轴,制作标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果),得到方程,将ΔA测定带入方程,得到y值。

2.乙酰辅酶A含量计算

1按样本蛋白浓度计算:

乙酰辅酶A含量(nmol/mg prot)=(y×V)÷(V×Cpr)×n=y÷Cpr×n

2按样本鲜重计算:

乙酰辅酶A含量(nmol/g 鲜重)=(y×V)÷(W×V÷V提取)×n=y÷W×n

3按细胞密度计算:

乙酰辅酶A含量(nmol/104 cells)=(y×V)÷(500×V÷V提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n

V:加入样本体积,0.025mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g;V提取:加入提取液体积,1 mL;500:细胞或细菌总数,500万n:样本稀释倍数

结果展示

典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。


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