产品简介
乙酰辅酶A (Acetyl-CoA) 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸，酮体，胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。本试剂盒提供了一种简单、灵敏、快速的乙酰辅酶A检测方法，其检测原理是苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，NADH在340nm处有特征吸收峰，通过检测340nm吸光值的计算既可得到乙酰辅酶A含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
试剂二 | 5μL | 10μL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
试剂四 | 15mL | 30mL | 4℃保存 |
标准品（NADH） | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机，低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：临用前配制，对于48T，加入125μL 试剂四 充分溶解备用；对于96T，加入250μL 试剂四 充分溶解备用，未用完的试剂-20℃分装保存。
试剂二：临用前配制，对于48T，加入125μL 试剂四 充分混匀备用；对于96T，加入250μL 试剂四 充分溶解备用，未用完的试剂4℃分装保存。
试剂三：临用前配制，对于48T，加入11.3mL试剂四充分溶解备用；对于96T，加入22.5mL 试剂四 充分溶解备用，未用完的试剂-20℃分装保存。
工作液：临用前请根据样本数配制，计算工作液体积（样本数×0.23 mL）,将试剂一、试剂二和试剂三按照1：1：90的比例混合，或者直接把试剂一和试剂二加入到试剂三混匀（可以测定48样或96样）。
标准品（NADH）：临用前配制，对于48T，加入0.5mL去离子水充分溶解备用；对于96T，加入1mL去离子水充分溶解备用，得8,000nmol/mL标准品，未用完的试剂-20℃分装保存。
标准曲线设置：按照如下表格，用去离子水将8,000 nmol/mL标准品稀释为3,200、1,600、800、400、200、100、50、0 nmol/mL的标准溶液。
标准液体积 | 去离子水体积（µL） | 浓度（nmol/mL） | |
Std.1 | 100 µL 8,000 nmol/mL | 150 | 3,200 |
Std.2 | 100 µL of Std.1 (3,200 nmol/mL) | 100 | 1,600 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (1,600 nmol/mL) | 100 | 800 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (800 nmol/mL) | 100 | 400 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (400 nmol/mL) | 100 | 200 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (200 nmol/mL) | 100 | 100 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (100 nmol/mL) | 100 | 50 |
Std.8 | 0 | 200 | 0 |
注意：Std.8即空白孔。
样本制备
细胞样本：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后13,000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织样本：称取0.1 g组织，加入 1mL提取液，冰浴匀浆，然后13,000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计去离子水调零。
2. 工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育10min。
3.测定：在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中，按照下表进行实验
测定孔（μL） | 标准孔（μL） | |
样本 | 25 | 0 |
不同浓度的标准品 | 0 | 25 |
工作液 | 230 | 230 |
混匀，测定孔读取340nm处20秒的吸光值A1和1分20秒时的吸光值A2，计算ΔA测=A2-A1，标准孔读取340 nm处1分20秒时的吸光值A标准，ΔA标=A标准-A空白。
注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以ΔA标为x轴，标准品浓度为y轴，制作标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果），得到方程，将ΔA测定带入方程，得到y值。
2.乙酰辅酶A含量计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
乙酰辅酶A含量(nmol/mg prot)=(y×V样)÷(V样×Cpr)×n=y÷Cpr×n
（2）按样本鲜重计算：
乙酰辅酶A含量(nmol/g 鲜重)=(y×V样)÷(W×V样÷V提取)×n=y÷W×n
（3）按细胞密度计算：
乙酰辅酶A含量(nmol/104 cells)=(y×V样)÷(500×V样÷V提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n
V样：加入样本体积，0.025mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；V提取：加入提取液体积，1 mL；500：细胞或细菌总数，500万；n：样本稀释倍数。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
