产品简介：

细胞发生凋亡时， 会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，产生180bp-200bp的 DNA 片段，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现的特异的梯状Ladder图谱。基因组DNA双链或单链断裂时会出现产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化作用下，与SuperFlour-dUTP结合，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪直接进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中广泛采用。

本试剂盒应用范围广，可用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。可选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。本试剂盒检测细胞凋亡，耗时短，只需一步染色反应，洗涤后即可检测。

产品内容：

自备材料：

PBS 缓冲液(pH~7.4)；4%多聚甲醛；牛血清白蛋白 (BSA) 或正常的羊、牛血清；70%乙醇(自选)；脱蜡溶剂(石蜡切片样本)

操作步骤：

一、样品的准备：

A) 对于贴壁细胞或细胞涂片：

1) PBS清洗2次。注：如果担心细胞涂片的细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。

2) 细胞固定：加入适量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液，4℃ 放置 30 min 。PBS清洗2次。

3) 通透细胞：加入适量0.2% Triton X- 100溶液(PBS配制)通透，室温放置 20 min 。PBS清洗2次。

4) 转步骤二的 TUNEL 反应。

B) 对于悬浮细胞或细胞悬液：

1) 收集细胞( 3~5×106个细胞)，1000 rpm离心5 min，PBS清洗2次。

2) 细胞固定：加入适量4%多聚甲醛(PBS配制)充分重悬细胞，4℃固定30 min。2000 rpm离心5 min，PBS清洗2次。

3) 通透细胞：加入适量0.2% Triton X-100(PBS配制)，室温通透20min。2000rpm离心5min，PBS清洗2次。

4) 转步骤二的 TUNEL 反应。

C) 石蜡组织切片的准备：

1) 脱蜡与水化：将切片样本依次放入二甲苯I（10 min）→ 二甲苯II（10 min）→ 100％乙醇I（5 min）→ 100％乙醇II（5 min）→ 95%乙醇（5 min）→ 90%乙醇（5 min）→ 80%乙醇（5 min）→ 70%乙醇（5 min）→ ddH2O冲洗5 min，冲洗2次。

注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。。

2) 用滤纸吸干切片样本周围液体，用免疫组化笔圈好样本轮廓，以便下游通透与标记。

注：若在后续实验操作中发现免疫组化笔画的轮廓圈被破坏，需及时补画。

3) 通透：按1:100的比例，将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1× PBS稀释至终浓度20 µg/mL，在每个样本上滴加100 µL，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育20 min。

注：Proteinase K可通透细胞膜和核膜，从而使后续步骤的染色试剂充分进入细胞核反应，提高标记效率。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。时间一般为10~30 min ，4µm左右的片子可用10 min ，但30µm 左右的可用30min。为得到更好的结果，Proteinase K的浓度、孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化。

4) PBS清洗切片2次，每次5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

注：这一步必须把Proteinase K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

5) 转步骤二的 TUNEL 反应。

D) 冰冻组织切片样品的准备：

1) 细胞固定：取出冰冻切片，并回温至室温。加入适量4%多聚甲醛(PBS配制)，室温固定30 min。PBS清洗2次，每次10 min。

注：若是担心甲醛清洗不干净，影响最终染色效果。可在甲醛固定完成后加入适量2 mg/mL 甘氨酸清洗 10 min，中和残留的固定液，再进行PBS清洗。

2) 用滤纸吸干切片样本周围液体，用免疫组化笔圈好样本轮廓，以便下游通透与标记。

注：若在后续实验操作中发现免疫组化笔画的轮廓圈被破坏，需及时补画。

3) 通透：按1: 100的比例，将2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀释至终浓度20 µg/mL，在每个样本上滴加100 µL，使溶液覆盖全部样本区域，20-37℃孵育20 min。

注：Proteinase K可通透细胞膜和核膜，从而使后续步骤的染色试剂充分进入细胞核反应，提高标记效率。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。时间一般为10~30 min ，4µm左右的片子可用10 min ，但30µm 左右的可用30min。为得到更好的结果，Proteinase K的浓度、孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化。

4) PBS清洗切片2次，每次5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

注：这一步必须把Proteinase K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

5) 转步骤二的 TUNEL 反应。。

E) 阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL反应步骤)

1) 按 1:10 的比例用 ddH2O 将 10X DNase I Buffer 稀释成 1X DNase I Buffer 备用。

2) 滴加 100 µL 1X DNase I Buffer 到已处理的样本上，覆盖全部样本区域，室温平衡 5 min。

3) 用 1X DNase I Buffer 以 1:100 稀释 DNase I (2 U/uL) ， 使其为终浓度 20 U/mL 的工作液。 

4) 轻轻吸掉样本上多余Buffer，加入 100 uL 浓度为 20 U/mL DNase I 工作液，室温孵育 10 min。

5) 轻轻吸掉多余DNase I 工作液，PBS 清洗样品 2 次。

6) 转步骤二的 TUNEL 反应。

二、配制 TUNEL 检测液：

A) 预先配制 TUNEL 反应混合液：每个样本需要已加入 1 uL TdT 酶的50 uL TUNEL 反应缓冲液。

B) 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片

1) 每个样本加入50 μL TUNEL反应液，使反应液均匀覆盖样本。37℃避光孵育适宜的时间(细胞推荐染色时间30 min-1h，组织染色时间推荐2 h)。

注：50 μL TUNEL反应液适合涂片、切片或96孔板(其他不同孔板可以适当调整TUNEL反应液体积，覆盖细胞即可)。如果待检测的样品为涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加TUNEL反应液后覆盖在样品上，可以防止TUNEL反应液蒸发，并且使TUNEL反应液均匀覆盖样本。

2) 弃去TUNEL 反应液，PBS清洗2次后，再用0.1% Triton X-100(PBS配制，其中含5mg/mL BSA)清洗3次，每次 5 min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。

3) (可选)每个样本加入适量浓度为5μg/mL的DAPI染液，室温避光孵育5 min。染色完成后，弃去DAPI染液，PBS清洗2次，每次5 min。

4) (可选)切片封片：每个样本滴加50 μL抗荧光淬灭封片剂(抗荧光淬灭封片剂可能会不适用于某些染料，实验前建议进行预实验测试匹配性)，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。

5) 用滤纸吸去多余的液体，向样本区域加100μL PBS保持样本湿润，立即在荧光显微镜下观察。

C) 对于悬浮细胞或细胞悬液

1) 每个样本管加入50μL TUNEL反应液轻轻重悬细胞，37℃避光孵育30~1h。每隔15min用微量移液器轻轻重悬细胞。

2) 2000 rpm离心5min，弃去TUNEL反应液，用0.1%Triton X-100(PBS配制，其中含5mg/mL BSA)清洗2次，每次5min，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。

3) 每个样本管加入100 μL浓度为5 μg/mL的DAPI染液，室温避光孵育5 min。

4) 加入400 μLPBS重悬细胞，立即用流式细胞仪检测或进行涂片后在荧光显微镜下观察。红色荧光Ex/Em=590/617nm

三、阴性处理

使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH2O替代TdT Enzyme进行实验。(主要是排除细胞自身凋亡、操作过程等原因导致的非特异性染色；以及调整拍摄曝光强度)

注意事项：

1) 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2) TUNEL Reaction Buffer 中含有 Sodium cacodylate trihydrate 和 Cobaltous chloride，使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤后， 请立即有大量水冲洗，废液请按有毒物质处理。

3) 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

4) 染色背景较重或非特异性着色明显时可适当减少染色时间。

5) 实验时建议增加阴性对照和阳性对照组。

6) 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

7) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。