产品简介
β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解,此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量,还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解,释放自由的半乳糖。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法,用于分析各种生物样品中β-GAL的活性。其原理是β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 2mL | 4mL | 4℃保存 |
试剂三 | 6.5mL | 13mL | 4℃保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测400nm处的吸光度)及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机、制冰机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:临用前48T加入1.25mL去离子水,96T加入2.5mL去离子水;充分溶解备用;用不完的试剂分装-20℃保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
标准品:标准品为5mM(μmol/mL)的对硝基苯酚溶液,使用前,平衡到室温;4℃保存。
标准曲线设置:按下表所示,用去离子水将5μmol/mL标准品稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6nmol/mL标准溶液 的标准溶液。
标准品体积(µL) | 去离子水体积(µL) | 标准品浓度(nmol/mL) | |
标准品1 | 40µL of 5μmol/mL | 160 | 1000 |
标准品2 | 100µL of 标准品1 (1000nmol/mL) | 100 | 500 |
标准品3 | 100µL of 标准品2 (500nmol/mL) | 100 | 250 |
标准品4 | 100µL of 标准品3 (250nmol/mL) | 100 | 125 |
标准品5 | 100µL of 标准品4 (125nmol/mL) | 100 | 62.5 |
标准品6 | 100µL of 标准品5 (62.5nmol/mL) | 100 | 31.25 |
标准品7 | 100µL of 标准品6 (31.25nmol/mL) | 100 | 15.6 |
注意:每次实验,请使用新配制的标准品。
样本制备
动植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液匀浆,15,000g,4℃离心10min,取上清液置冰上待测。
细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),15,000g,4℃离心10min,取上清液置冰上待测。
血清(浆)或培养液等液体样本:直接测定,根据预实验确定稀释倍数。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。 如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到400nm,可见分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定:在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂
标准(μL) | 空白(μL) | 测定(μL) | 对照(μL) | |
试剂一 | 25 | 25 | 25 | 0 |
去离子水 | 0 | 10 | 0 | 25 |
试剂二 | 35 | 35 | 35 | 35 |
标准品 | 10 | 0 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 10 | 10 |
迅速混匀,放入37℃保温30min | ||||
试剂三 | 130 | 130 | 130 | 130 |
充分混匀, 400nm处测定吸光值A,计算ΔA测定=A测定-A对照,ΔA标准=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照,空白只需要测一次。
注意:1.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于0.6,样本可用去离子水进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1.标准曲线的绘制:
以标准品浓度为y轴,ΔA标准为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将 ΔA测定带入方程计算出y 值(nmol/mL)。
1. 样本β-GAL活性计算
(1)按样本质量计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位U。
β-GAL活性(U/g 质量)=(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=14×y÷W
(2)按液体样本体积计算
单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位U。
β-GAL活性(U/mL)=(y×V反总)÷V样÷T=14×y
(3)按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位U。
β-GAL活性(U/104 cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.028×y
(4)按蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位U。
β-GAL活性(U/mg prot)=(y×V反总)÷(Cpr×V样)÷T=14×y÷Cpr
V反总:反应体系总体积,0.07mL;W:样本质量,0.1g;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5h;;500:细胞或细菌总数,500万;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。