产品简介
莽草酸途径是存在于植物、真菌和微生物中的一条重要的代谢途径，莽草酸脱氢酶是莽草酸合成途径中的关键酶。 本试剂盒提供了一种简便的 比色测定法，用于测定样本中的SD活性。其原理是莽草酸脱氢酶催化莽草酸和NADP产生NADPH，检测340nm下的吸光值增加速率来表示SD活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 |
储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 12.5mL | 25mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂1瓶 | 粉剂2瓶 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）及恒温箱
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：使用时在每瓶试剂二中加入10mL试剂一充分溶解混匀，置于25℃孵育5min，现配现用。
样本制备
组织：称取0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，转移到1.5mL EP管中，8,000g,4℃ 离心10min, 取上清液于新离心管中，置冰上检测。
细菌或真菌：先收集细菌或真菌到离心管内，离心后弃上清；按500万细菌或真菌加入1mL提取液的比例加入提取液，冰浴超声波破碎5min (功率20%或200W, 超声3s, 间隔7s,重复30次),转移到1 . 5mL EP 管中，8,000g,4℃离心10min, 取上清液于新离心管中，置冰上检测。
培养液等液体样本：直接检测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。
如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm, 紫外分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定：在96孔板或微量石英比色皿中加入10μL样本和190μL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA小于0.001可适当加大样本量，如果ΔA大于 1.0，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
A.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按样本鲜重计算：
酶活力单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD（U/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=1286×ΔA÷W
（2）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SD（U/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.572×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
B.使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测 血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
