产品简介
谷氨酸脱羧酶(GAD)是一种钙调素激活的胞质酶，它将谷氨酸转化成γ-氨基丁酸(GABA)，是GABA生物合成的关键限速酶。γ-氨基丁酸（GABA）在动物中是中枢神经系统中有效的抑制性神经递质，具有降血压、增进脑活力、营养神经细胞、保持神经安定、促进生长激素分泌和保肝利肾等作用，目前在医药和保健食品中已有广泛的应用。GABA也在许多植物胁迫中积累。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本中谷氨酸脱羧酶（GAD）的活性水平。其原理是GAD催化谷氨酸产生GABA，利用 berthelot反应测定GABA含量，从而测定GAD活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 6mL | 12mL | 4℃保存 |
试剂二 | 6mL | 12mL | -20℃避光保存 |
试剂三 | 2.5mL | 5mL | 4℃保存 |
试剂四 | 3mL | 6mL | 4℃保存 |
试剂五 | 6mL | 12mL | 4℃避光保存 |
试剂六 | 6mL | 12mL | 4℃保存 |
试剂七 | 12.5mL | 25mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测640nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
所有试剂均为即用型；使用前，平衡到室温。按储存条件保存。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）等液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长至640nm，去离子水调零。
2. 样本测定（在EP管中加入下列试剂）：
试剂名称 | 测定管（μL） | 对照管（μL） |
样本 | 100 | 0 |
95℃水浴灭活样本 | 0 | 100 |
试剂一 | 100 | 100 |
试剂二 | 100 | 100 |
混匀，40℃水浴1h，95℃水浴10分钟终止反应，冷却至室温，快速离心，取反应液加入新EP管中 | ||
反应液 | 40 | 40 |
试剂三 | 10 | 10 |
试剂四 | 50 | 50 |
试剂五 | 100 | 100 |
混匀，室温静置5min。 | ||
试剂六 | 100 | 100 |
混匀，室温静置5min。 | ||
试剂七 | 200 | 200 |
混匀，取200μL上清液至微量石英比色皿或96孔板中，测定640nm处的吸光值A。△A=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.0，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准条件下测定回归方程为y=0.0682x-0.0432，R2=0.999；x 为标准品浓度（μmol/mL），y 为吸光值。
2. GAD 活力计算：
（1）按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。
GAD 活力(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA+0.0432)÷0.0682×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=0.733×(ΔA+0.0432）÷W
（2）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每104个细菌或细胞每分钟催化产生1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。
GAD 活力(μmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0432)÷0.0682×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T =0.0015×(ΔA+0.0432)
（3）按照蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1μmolGABA定义为一个酶活力单位。
GAD 活力(μmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0432)÷0.0682×V反总÷(V样×Cpr)÷T=0.733×(ΔA+0.0432)÷Cpr
（4）按液体样本体积计算
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟催化产生1μmolGABA定义为一个酶活力单位。
GAD 活力(μmol/min/mL)=(ΔA+0.0432)÷0.0682×V反总÷V样÷T=0.733×(ΔA+0.0432)
V反总：反应体系总体积， 0.3mL；V样：加入样本体积：0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，60min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
