产品简介
Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)。Caspase 是一类蛋白酶家族,成员较多,该家族已显示在凋亡中起关键作用。哺乳动物caspases 可分为三个功能组:启动子半胱天冬酶(Caspase-2、8、9 和 10),执行者半胱天冬酶(Caspase-3、6 和 7)和炎性半胱天冬酶(Caspase-3、4、5、11 和 12)。Caspase-3(也称为Yama,CPP32 和 Apopain)在天冬氨酸残基的羧基末端切割其底物。活性 Caspase-3由两组同源二聚体(17 和 12 kDa) 组成,它们均来自两个前体 Caspase -3 多肽,并具有两个活性位点。Caspase-3 与 Caspases-8 和 9一起位于细胞凋亡途径的关键连接点。本试剂盒基于Caspase-3 水解肽底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-对硝基苯胺),产生黄色的对硝基苯胺(pNA),pNA 在405nm 附近有强吸收,从而可以通过测定吸光度来检测 Caspase-3的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | ||
20T | 50T | 100T | ||
细胞裂解液 | 20mL | 50mL | 100mL | 4℃ |
反应缓冲液(2×) | 5mL | 10mL | 20mL | 4℃ |
底物 | 140μL | 350μL | 700μL | -20℃,避光保存 |
pNA标准品(10mM) | 100μL | 250μL | 500μL | -20℃,避光保存 |
DTT | 300μL | 750μL | 1.5mL | -20℃ |
自备耗材
酶标仪(能测405nm处的吸光度)
低温离心机、制冰机
96孔板、可调节式移液枪及枪头
去离子水、磷酸盐缓冲液 (PBS)
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
细胞裂解液: 使用前按1mL细胞裂解液加入10 µL DTT的比例加入DTT,置于冰上备用。
1×反应缓冲液 (含 DTT): 使用前将反应缓冲液(2×)加等体积去离子水稀释到反应缓冲液 (1×),再按1mL反应缓冲液 (1×)加入10µL DTT的比例加入DTT,置于冰上备用。
底物: 即用型;实验过程中置于冰上;–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存,避免反复冻融。
DTT : 即用型;实验过程中置于冰上;–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存,避免反复冻融。
标准曲线设置:取20µL pNA标准品 (10mM)用180µL 1×反应缓冲液(含 DTT)稀释至1000µM pNA标准品。用1000µM pNA按下表所示,进行下一步稀释:
标准品体积 | 1×反应缓冲液 (含DTT)体积(µL) | 浓度 (µM) | |
Std.1 | 200µL of 1000µM pNA | 0 | 1000 |
Std.2 | 100µL of Std.1(1000µM) | 100 | 500 |
Std.3 | 100µL of Std.2 (500µM) | 100 | 250 |
Std.4 | 100µL of Std.3 (250µM) | 100 | 125 |
Std.5 | 100µL of Std.4 (125µM) | 100 | 62.5 |
Std.6 | 100µL of Std.5 (62.5µM) | 100 | 31.25 |
Std.7 | 100µL of Std.6 (31.25µM) | 100 | 15.6 |
注意:每次实验,请使用新配制的标准品。用不完的标准品-20℃避光分装保存,避免反复冻融
样本制备
1. 通过所需方法诱导细胞凋亡。同时,建议对每个样本设置不诱导的对照培养。
对于贴壁细胞,胰蛋白酶消化收集细胞。600g,4℃离心5min,小心吸去上清液。用1mL PBS洗涤细胞2次。离心后,去除上清液。在1mL细胞裂解液中重悬 5×106个细胞。
对于悬浮细胞,600g,4℃离心5min,小心吸去上清液。用1mL PBS 洗涤细胞2次。离心后,去除上清液。在1mL细胞裂解液中重悬 5×106个细胞。
对于组织,将0.1g组织切成小块,用PBS清洗组织,加入1mL细胞裂解液,冰浴匀浆。
2. 裂解物冰上孵育 15-20min。
3. 16,000g,4℃离心15min,然后将上清液转移至新EP管中,置冰上待测。
4. 立即测定 Caspase-3 的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用 Bradford 法测定蛋白浓度。
注意:1. 推荐使用新鲜样品。如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存一个月,使用前,在冰上解冻。
2. 在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂,可能会干扰测定。
3. 如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford 法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪预热30min以上,调节波长到405nm。
2. 操作表(下述操作在96孔板中操作):
试剂 | 空白孔(μL) | 标准孔(μL) | 测定孔(μL) |
1×反应缓冲液 (含 DTT) | 100 | 50 | 50 |
不同浓度标准品 | 0 | 50 | 0 |
样本上清 | 0 | 0 | 50 |
底物 | 5 | 5 | 5 |
3. 混匀,37℃孵育1-2h,检测405nm处吸光值。空白孔记为A空,标准孔记为A标、测定孔记为A测。计算 ΔA测=A测-A空,ΔA标=A标-A空。
注意:1.空白孔只需测定1次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验;如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量,如果ΔA测大于1.0,用细胞裂解液适当稀释样品后再进行测定,计算结果乘以稀释倍数。
2.在反应体系中,适当混匀,注意避免在混匀时产生气泡;3.发现颜色变化比较明显时即可测定405nm 的波长。如果颜色变化不明显,可以适当延长孵育时间,甚至可以孵育过夜。
结果计算
1. 标准曲线的绘制:
以ΔA 标为x轴,标准溶液浓度为y轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将样本的 ΔA测带入方程得到y值(μM即nmol/mL)。
2. Caspase-3 活性的计算
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义:为当底物饱和时,37℃环境下,每毫克蛋白在反应体系中每小时剪切1nmol pNA 底物产生1nmol游离pNA 的酶量定义为1个酶活力单位。
Caspase-3 活性(U/mg prot)=y×V反总÷(V样×Cpr)÷T=2.1×y÷Cpr÷T
(2)按样本鲜重计算
活性单位定义:为当底物饱和时,37℃环境下,每克样本在反应体系中每小时剪切1nmol pNA 底物产生1nmol游离pNA 的酶量定义为1个酶活力单位。
Caspase-3 活性(U/g 鲜重)=y×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=2.1×y÷W÷T
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:为当底物饱和时,37℃环境下,每104个细胞在反应体系中每小时剪切1nmol pNA 底物产生1nmol游离pNA 的酶量定义为1个酶活力单位。
Caspase-3 活性(U/104 cell)=y×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=2.1×y÷细胞数量÷T
V反总:反应体系总体积,0.105mL;V样:加入的样本体积,0.05mL;T:反应时间,h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品鲜重,g;V样总:加入提取液的体积,1mL;细胞数量:以万为单位的细胞数量。
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