产品简介

脂滴是由磷脂单分子层及甘油三酯(Triglyceride)、胆固醇酯(Cholesteryl ester，CE)组成的中性脂肪(Neutral lipid)疏水核心构成，广泛存在于动物、细菌、酵母、植物和昆虫细胞中。脂滴能够沿着细胞骨架运动，并与其它细胞器相互作用，在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解、以及信号传导过程中起着重要的作用。多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病和Niemann Pick C疾病等，可能都伴随着脂质贮存的异常。本试剂盒英文名为Lipid Droplets Red Fluorescence Assay Kit with Nile Red，也称 Nile Red Staining Kit或Red Neutral Lipid Stain，是一种基于荧光探针尼罗红(Nile Red)来检测细胞内脂滴(Lipid droplets) 的试剂盒。本试剂盒所使用的荧光探针为尼罗红(Nile Red)，其在磷脂 (phospho-lipid)中最大激发光波长约为552nm，最大发射光波长约为636nm，此时为红色荧光；也可以把激发波长设置为450-500nm，发射波长设置为大于528nm，此时为绿色荧光；但红色荧光通常比绿色荧光明亮很多。由于Nile Red在红色荧光时也可以染细胞膜，而在绿色荧光时只染脂滴，所以如果特别关注脂滴的特异性时，也可以设置参数为Ex/Em=485/535nm进行检测。Nile Red在水和其它极性溶剂中几乎无任何荧光，一旦与甘油三酯等中性脂肪结合，便发出明亮的红色荧光(由于其发射光谱范围广，也可以设置参数观察到绿色荧光)。本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测系统。

产品内容

自备耗材

荧光显微镜或流式细胞仪或荧光酶标仪、离心机

细胞培养板、可调节式移液枪及枪头

PBS

试剂准备

Nile Red（1000×）:实验过程中冰上避光放置，分装-20℃避光保存，避免反复冻融。

Hoechst 33342（1000×）: 实验过程中冰上避光放置，分装-20℃避光保存，避免反复冻融。

反应缓冲液：使用前预热到37℃。

染色溶液配制：按每1mL反应缓冲液中加入1µL Nile Red（1000×）和1µL Hoechst 33342（1000×）的比例配制，根据使用样本的数量按比例放大实验。

注意：1. 各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

2. 配制好的染色溶液必须一次使用完毕，不建议冻存或4ºC保存后继续使用。

3. 由于Nile Red的发射光谱范围广，即有绿色荧光也有红色荧光，所以尽量避免其它荧光的染色和检测。如果一定要进行双重染色，由于Nile Red在激光照射下很快淬灭，所以可以先检测Nile Red，并在淬灭后再进行其它荧光的检测。

4. 为得到比较理想的结果，可根据细胞类型和实际染色效果对Nile Red的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等进行适当摸索和优化，例如：Nile Red的浓度可在0.2×-2×之间适当调整。对于96孔板中的样品，按照每孔使用100μl染色液计算，本试剂盒的100T-1000T和500T-5000T可以进行1000次和5000次检测；如果用于流式细胞仪检测，按照每个样品的检测体系体积为0.5ml时，本试剂盒的100T-1000T和500T-5000T可以进行200次和1000次检测；对于6孔板中的贴壁培养细胞样品，按照每孔使用1ml染色液计算，本试剂盒的100T-1000T和500T-5000T可以进行100次和500次检测。

实验步骤

A. 荧光显微镜检测 

1. 接种培养：将细胞接种于6孔板等多孔板、细胞培养皿或者细胞爬片上。如有必要，按实验设计对细胞进行一定处理。

2. 固定(选做)：

(1) 取出待检测的细胞，使用PBS洗涤两遍，吸除PBS。

(2) 加入4%多聚甲醛固定液 (PMK0240)室温固定10-15分钟。

注1：Nile Red和Hoechst 33342都适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色。

注2：由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。

注3：如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用不会溶解细胞膜的去垢剂如含Saponin或Digitonin的通透液，但仍然可能会一定程度的影响脂滴的形态。

3. 染色：

(1) 取出待检测的细胞，PBS洗涤两遍。

(2) 吸除PBS，加入适当体积的染色溶液，通常96孔板每孔加入100μL，24孔板每孔加入250μL，12孔板每孔加入500μL，6孔板每孔加入1mL。室温下避光孵育10-20分钟。

(3) PBS洗涤两遍。

4. 检测：使用荧光显微镜观察时选择使用552nm左右激发，观察红色荧光；也可以使用485nm左右激发，观察绿色荧光。

注：使用荧光显微镜拍照时，为了减少荧光淬灭，尽可能降低荧光显微镜的激发光强度，缩短拍照时间。 

B. 流式细胞仪检测：

1. 细胞准备：

(1) 贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用PBS洗涤一次；悬浮细胞250-1000×g室温离心5分钟，弃上清，用PBS 洗涤一次。每个样品推荐的细胞用量为10⁶个细胞。

(2) 400×g室温离心5分钟，弃上清。

2. 固定(选做)：

(1) 加入4%多聚甲醛固定液 (PMK0240)，轻轻吹打重悬为单细胞悬液，室温固定10-15分钟。

(2) 固定结束后，400×g室温离心5分钟，弃上清。

(3) 加入0.5ml PBS后缓慢用移液器吹打洗涤，然后400×g室温离心5分钟，弃上清。

注1：Nile Red和Hoechst 33342都适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色。

注2：由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。

注3：如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用不会溶解细胞膜的去垢剂如含Saponin或Digitonin的通透液，但仍然可能会一定程度的影响脂滴的形态。

3.染色:

(1) 对于上一步骤的细胞沉淀，除背景对照管外，其余每管加入0.5mL染色溶液，轻柔并充分重悬细胞，室温避光孵育10-15分钟。

(2) 400×g室温离心5分钟，弃上清。

(3) 每孔加入0.5mL PBS后缓慢用移液器吹打洗涤，然后400×g室温离心5分钟，弃上清。

(4) 每孔加入0.5mL PBS重悬细胞。

4. 检测：检测时参考其光谱特征选择合适的检测条件，例如Ex/Em=552/636nm或Ex/Em=485/535nm。

注1：使用仅含反应缓冲液并且未经染色的细胞样品用于流式细胞仪的阴性对照设置。

注2：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对Nile Red的稀释倍数进行适当调整。

C. 荧光酶标仪检测：

1.接种培养:将细胞接种于96孔板黑色多孔板中，如BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)，每孔的细胞数需要控制在100-10,000个，通常宜在2000-5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理。

2.  固定(选做):

(1) 取出待检测的细胞，使用PBS洗涤两遍，吸除PBS。

(2) 加入4%多聚甲醛固定液(PMK0240)室温固定10-15分钟。

注1：Nile Red和Hoechst 33342都适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色。

注2：由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。

注3：如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用不会溶解 细胞膜的去垢剂如含Saponin或Digitonin的通透液，但仍然可能会一定程度的影响脂滴的形态。

3.染色: 

(1) 取出待检测的细胞，使用PBS洗涤两遍。

(2) 吸除PBS，加入适当体积的染色溶液，通常96孔板每孔加入100μL。室温下避光孵育10-20分钟。

(3) PBS洗涤两遍。

4. 检测:参考其光谱特征，选取合适的波长进行读板，例如Ex/Em=552/636nm或Ex/Em=485/535nm。具体根据酶标仪的特点选择，也不一定需要选用最大激发光/发射光波长来检测。

D.阳性对照的诱导方法：

油酸（CAS：112-80-1）可以诱导培养细胞内脂滴生成，从而可以作为阳性对照。诱导培养细胞内形成脂滴的具体方法如下：

1. 37ºC条件下加热油酸，使其完全成为液体。

2. 取48μL的油酸，加入到952μL的DMSO中，充分混匀，配制成150mM的油酸贮存液。贮存液可以保存在

4ºC，使用时37ºC条件下加热混匀后即可使用。

3.细胞诱导前，配制含油酸的完全培养液。使用细胞的完全培养液按1：500稀释油酸贮存液，使油酸终浓度为300μM。

注：油酸具有一定的细胞毒性，因细胞而异，可以根据不同细胞状况调整油酸的使用终浓度。

4. 待检测的细胞加入含油酸的完全培养液，37ºC培养过夜。一般情况下，次日可以观察到囊泡状的脂滴。 

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