产品简介

Calcein AM是在Calcein (钙黄绿素)的基础上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基团，加强了疏水性，因此能够很容易穿透活细胞膜，进入细胞内，从而标记细胞。Calcein AM本身并无荧光，进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解生成具有强负电荷的不能通透细胞膜的极性分子钙黄绿素(Calcein)，从而被滞留在细胞内，而Calcein可发出强绿色荧光。由于死细胞缺乏酯酶，Calcein AM进入细胞后仅活细胞会被染色为绿色荧光，所以可对活细胞进行定量荧光检测。与其它同类探针相比，由于Calcein AM的细胞毒性非常低，几乎不会影响细胞功能如细胞增殖或淋巴细胞的趋化性等，而且对pH值敏感性低，所以Calcein AM是目前活细胞荧光染色的最理想探针之一。近年来Calcein AM也被广泛用于细胞活性、细胞毒性或细胞增殖的检测。Calcein AM细胞活性检测试剂盒是一种通过Calcein-AM荧光探针标记活细胞从而简单、快速、灵敏、准确地用于细胞活性、细胞毒性或细胞增殖检测的试剂盒。本试剂盒由于能用于活细胞的精确定量，也被称为细胞荧光计数试剂盒(Cell Fluorescence Counting Kit)，简称Cell Fluorescence Counting Kit-F、CCK-F或CCKF。本试剂盒通常推荐使用荧光酶标仪进行定量检测，也可以使用流式细胞仪进行定量检测。如果有必要，也可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行细胞的荧光检测。

产品内容

自备耗材

荧光酶标仪或流式细胞仪或荧光显微镜、离心机

细胞培养板、可调节式移液枪及枪头

PBS

试剂准备

Calcein AM: 冰上避光保存。

反应缓冲液：使用前预热到 37℃。

染色溶液配制：按每1mL反应缓冲液中加入1µL Calcein AM的比例配制，根据使用样本的数量按比例放大实验。

注意：1. 各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

2. 本试剂盒提供的Calcein AM为1000×溶液。该1000×的Calcein AM溶液经过优化，对大多数细胞都适用，但为得到比较理想的结果，也可根据细胞类型和实验实际情况对Calcein AM在500-2000稀释倍数之间进行适当调整。对于96孔板，按推荐稀释倍数配制相关检测试剂，且每孔使用100μl，此时本试剂盒的100T、500T、2500T分别可以检 测100次、500次和2500次。

3. 配制好的染色溶液必须一次使用完毕，不能冻存。也可以用其它合适的溶液，如无血清培养液、HBSS稀释Calcein AM (1000×)。

实验步骤

A.贴壁细胞的荧光酶标仪检测或荧光显微镜检测： 

1.接种培养：将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。如果用于96孔荧光酶标仪检测，细胞须接种于黑色多孔板，如BeyoGold™全黑96孔细胞培养板中，每孔的细胞数需要控制在100-10000个，通常宜在2000-5000个范围内。

2. 洗涤：吸除培养液，用PBS洗涤细胞2遍。酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰，需要洗涤除去。

3. 染色：加入适当体积的染色溶液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37ºC避光孵育30min。不同的细胞最佳孵育时间有所不同，以30min作为初始孵育时间，后续可以根据实际染色效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到更加理想的染色效果。

4. 检测：孵育结束后，可以直接用荧光酶标仪(激发波长494nm，发射波长517nm，490nm和520nm也可以)检测荧光并计算细胞活性，细胞活性和荧光强度成正比。根据具体的实验目的，也可以在荧光显微镜下观察染色效果。

B.悬浮细胞的荧光酶标仪检测或荧光显微镜检测： 

1. 接种培养：将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中，按实验设计对细胞进行一定处理。如果用于96孔荧光酶标仪检测，细胞须接种于黑色多孔板，如BeyoGold™全黑96孔细胞培养板中，每孔的细胞数需要控制在100-10000个，通常宜在2000-5000个范围内。

2. 洗涤：1000×g室温离心5min，吸除上清，用PBS洗涤2遍。酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰，需要洗涤除去。

3. 染色：加入适当体积的染色溶液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl， 6孔板每孔加入1ml。37ºC避光孵育30min。不同的细胞最佳孵育时间有所不同，以30min作为初始孵育时间，后续可以根据实际染色效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到更加理想的染色效果。

d. 检测：孵育结束后，可以直接用荧光酶标仪(激发波长494nm，发射波长517nm，490nm和520nm也可以)检测荧光并计算细胞活性，细胞活性和荧光强度成正比。根据具体的实验目的，也可以在荧光显微镜下观察染色效果。

C. 流式细胞仪检测： 

1. 细胞准备：贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用PBS洗涤2次。悬浮细胞1000×g室温离心5min，弃上清，用PBS 洗涤2次。每个样品推荐的细胞用量为1×10⁶。

2. 染色：对于上一步骤的1×10⁶个细胞的沉淀，加入1ml 染色溶液，重悬为单细胞悬液。37℃避光孵育30min。

注意：需要准备好仅含缓冲液的细胞样品用作流式细胞仪检测时的阴性对照，该缓冲液与配制染色溶液的缓冲液宜保持一致。

检测：孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测，也可以1000×g室温离心5min沉淀细胞，吸净液体后每个样品加入0.5ml缓冲液重悬细胞后用流式细胞仪检测。如有需要，也可进行进一步染色。注意整个过程均需避光操作。染色后，将样品置于冰上，尽量在1小时内进行流式细胞仪检测和分析。注意使用仅含检测缓冲液的并且未经染色的细胞样品用于流式细胞仪的阴性对照设置。

注意事项

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。

3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。

5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。

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