产品简介
丙酮酸脱氢酶（PDH；EC 1.2.4.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，分布在线粒体基质中，是由三个酶组合的复合体，负责催化丙酮酸脱羧，生成乙酰辅酶A的不可逆反应。PDH是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱羧生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的PDH活性检测方法，其原理是PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原WST-8产生黄色物质，从而导致450nm光吸收的增加。通过检测450nm吸光值的增加既可计算PDH活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | -20℃避光保存 |
试剂四 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃避光保存 |
试剂六 | 1.5mL | 2.5mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计（能测450nm处的吸光度）
96孔板或微量比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机，低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
试剂五：临用前48T加入5mL去离子水，96T加入10mL去离子水溶解待用；分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。
工作液：临用前配制，按照试剂四：试剂五：试剂六=100μL：60μL：20μL的比例，依样本数量配制工作液。用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
组织、真菌中胞浆蛋白与线粒体蛋白的提取:
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mL试剂一和10µL试剂三，冰浴匀浆；
2. 离心匀浆液，600g，5min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；
3. 再次离心上清，11,000 g, 10min, 4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；
4. 上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的丙酮酸脱氢酶（PDH）；
5. 在沉淀中加入200µL试剂二和2µL试剂三，充分重悬沉淀，用于线粒体丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm。分光光度计去离子水调零。
2. 工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育10min。
3. 样本测定：在 96 孔板中加入20μL样本和180μL工作液，混匀，立即记录450nm处初始吸光值A1和 2min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
注意：1.实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量；如果ΔA大于0.3，可用试剂二稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本），不推荐同时测多个样本。
结果计算
标准曲线为y=6.7928x-0.0009，R2=0.9991；其中y为ΔA，x为浓度μmol/mL。
1.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟还原1nmol WST-8 定义为一个酶活性单位。
PDH上清(U/g鲜重)=(ΔA上清+0.0009)÷6.7928×V反总÷(W×V样÷V提取)÷T×1000=743.43×(ΔA上清+0.0009)÷W
PDH沉淀(U/g鲜重)=(ΔA沉淀+0.0009)÷6.7928×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×1000=148.69×(ΔA沉淀+0.0009)÷W
PDH总(U/g 鲜重)=PDH上清+PDH沉淀=743.43×(ΔA上清+0.0009)÷W+148.69×(ΔA沉淀+0.0009)÷W
2.按真菌密度计算
单位的定义：每1万个真菌每分钟还原1nmol WST-8 定义为一个酶活性单位。
PDH上清(U/104 cells)=(ΔA上清+0.0009)÷6.7928×V反总÷(500×V样÷V提取)÷T×1000=1.487×(ΔA上清+0.0009）
PDH沉淀(U/104 cells)=(ΔA沉淀+0.0009)÷6.7928×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T×1000=0.297×(ΔA沉淀+0.0009)
PDH总(U/104 cells)=PDH上清+PDH沉淀=1.487×(ΔA上清+0.0009）+0.297×(ΔA沉淀+0.0009)
V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：样本总体积，0.202mL；V提取：加入提取液体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：真菌总数，500万;1000，μmol到nmol的转换系数。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
