产品简介
丙酮酸脱氢酶(PDH;EC 1.2.4.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,分布在线粒体基质中,是由三个酶组合的复合体,负责催化丙酮酸脱羧,生成乙酰辅酶A的不可逆反应。PDH是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶,催化丙酮酸脱羧生成羟乙基-TPP,把糖酵解和三羧酸循环连接起来。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的PDH活性检测方法,其原理是PDH催化丙酮酸脱氢,同时还原WST-8产生黄色物质,从而导致450nm光吸收的增加。通过检测450nm吸光值的增加既可计算PDH活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | -20℃避光保存 |
试剂四 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃避光保存 |
试剂六 | 1.5mL | 2.5mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计(能测450nm处的吸光度)
96孔板或微量比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机,低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;-20℃避光保存。
试剂五:临用前48T加入5mL去离子水,96T加入10mL去离子水溶解待用;分装后-20℃避光保存,避免反复冻融。
工作液:临用前配制,按照试剂四:试剂五:试剂六=100μL:60μL:20μL的比例,依样本数量配制工作液。用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
样本制备
组织、真菌中胞浆蛋白与线粒体蛋白的提取:
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞,加入1mL试剂一和10µL试剂三,冰浴匀浆;
2. 离心匀浆液,600g,5min,4℃,收集上清液至另一新的离心管中,舍弃沉淀;
3. 再次离心上清,11,000 g, 10min, 4℃,沉淀即为提取的线粒体,用作第5步操作;
4. 上清液即为胞浆提取物,可作为样本用于测定从线粒体泄漏的丙酮酸脱氢酶(PDH);
5. 在沉淀中加入200µL试剂二和2µL试剂三,充分重悬沉淀,用于线粒体丙酮酸脱氢酶(PDH)活性检测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失活。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上,调节波长到450nm。分光光度计去离子水调零。
2. 工作液于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育10min。
3. 样本测定:在 96 孔板中加入20μL样本和180μL工作液,混匀,立即记录450nm处初始吸光值A1和 2min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
注意:1.实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量;如果ΔA大于0.3,可用试剂二稀释样品,计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)。
3. 因通过反应速率计算酶活,使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本),不推荐同时测多个样本。
结果计算
标准曲线为y=6.7928x-0.0009,R2=0.9991;其中y为ΔA,x为浓度μmol/mL。
1.按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟还原1nmol WST-8 定义为一个酶活性单位。
PDH上清(U/g鲜重)=(ΔA上清+0.0009)÷6.7928×V反总÷(W×V样÷V提取)÷T×1000=743.43×(ΔA上清+0.0009)÷W
PDH沉淀(U/g鲜重)=(ΔA沉淀+0.0009)÷6.7928×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×1000=148.69×(ΔA沉淀+0.0009)÷W
PDH总(U/g 鲜重)=PDH上清+PDH沉淀=743.43×(ΔA上清+0.0009)÷W+148.69×(ΔA沉淀+0.0009)÷W
2.按真菌密度计算
单位的定义:每1万个真菌每分钟还原1nmol WST-8 定义为一个酶活性单位。
PDH上清(U/104 cells)=(ΔA上清+0.0009)÷6.7928×V反总÷(500×V样÷V提取)÷T×1000=1.487×(ΔA上清+0.0009)
PDH沉淀(U/104 cells)=(ΔA沉淀+0.0009)÷6.7928×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T×1000=0.297×(ΔA沉淀+0.0009)
PDH总(U/104 cells)=PDH上清+PDH沉淀=1.487×(ΔA上清+0.0009)+0.297×(ΔA沉淀+0.0009)
V反总:反应体系总体积,0.2mL;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:样本总体积,0.202mL;V提取:加入提取液体积,1.01mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:真菌总数,500万;1000,μmol到nmol的转换系数。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。