产品简介
肌酐（creatinine，Cr）是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外。血中的肌酐来源包括外源性和内源性两部分。外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。血肌酐几乎全部经肾小球滤过进入原尿，并且不被肾小管重吸收；内源性肌酐每日生成量几乎保持恒定，严格控制外源性肌酐的摄入时，血肌酐浓度为稳定值，因此，测定血肌酐浓度可以反映肾小球的滤过功能。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于检测样本中肌酐含量。其原理是：肌酐酶可催化肌酐产生肌酸，肌酸酶催化肌酸产生肌氨酸和尿素。肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化产生过氧化氢，过氧化物酶催化过氧化氢氧化4-氨基安替比林偶联酚，生成红色醌类化合物；在500nm有特征吸收峰。测500nm处的吸光值，即可测定样品中肌酐含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | ||
48T | 96T | |||
提取液 | 10mL | 20mL | 4℃保存 | |
试剂一 | 7.5mL | 15mL | 4℃避光保存 | |
试剂二 | 1 | 1 | -20℃避光保存 | |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃保存 | |
标准品（10mg肌酐） | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测500nm处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂二：临用前96T加入5mL 试剂三，48T加入2.5mL 试剂三充分混匀待用。用不完的试剂可4℃保存一周或分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液的配制：每孔配制200µL工作液：吸取50µL溶解后的试剂二，150µL 试剂一。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。
标准品：含10 mg肌酐，临用前加入1mL去离子水溶解得10 mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或分装-20℃长期保存。
标准曲线设置：按下表所示，用去离子水将10mg/mL标准品稀释为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液。
标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（mg/mL） | |
标准品1 | 8µL 10mg/mL | 192 | 0.4 |
标准品2 | 100µL of 标准品1 (0.4mg/mL) | 100 | 0.2 |
标准品3 | 100µL of 标准品2 (0.2mg/mL) | 100 | 0.1 |
标准品4 | 100µL of 标准品3 (0.1mg/mL) | 100 | 0.05 |
标准品5 | 100µL of 标准品4 (0.05mg/mL) | 100 | 0.025 |
标准品6 | 100µL of 标准品5 (0.025mg/mL) | 100 | 0.0125 |
标准品7 | 100µL of 标准品6 (0.0125mg/mL) | 100 | 0.00625 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心10min，取上清液待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后12,000g，4℃离心10min，取上清待测。
血清（浆）、尿液等液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜血清样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到500nm，可见分光光度计去离子水调零；恒温箱预热到37℃。
2. 样本测定（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：
标准（μL） | 空白（μL） | 测定（μL） | 对照（μL） | |
不同浓度标准品 | 20 | 0 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 20 | 20 |
去离子水 | 0 | 20 | 0 | 0 |
工作液 | 200 | 200 | 200 | 0 |
试剂三 | 0 | 0 | 0 | 200 |
混匀，37℃静置60min，测定500nm 处吸光值A。空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测，对照孔记为A对。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA大于 1.0，样本可用提取液适当稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入方程得到y值（mg/mL）。
2. 肌酐含量计算
1）按照样本鲜重计算
肌酐含量（mg/g 鲜重）=y×V样÷(W×V样÷V样总)×n=y÷W×n
2）按照细菌或细胞数量计算
肌酐含量（mg/104 cell）=y×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)×n=y÷500×n=0.002×y×n
3）按照液体体积计算
肌酐含量（mg/mL）=y×V样÷V样×n=y×n
4）按照蛋白浓度计算
肌酐含量（mg/mg prot）= y×V样÷(V样×Cpr) ×n=y÷Cpr×n
V样：加入样本体积，0.02mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；n：样本稀释倍数； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞数量，500万。
结果展示
典型标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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