产品简介

谷胱甘肽是甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的天然三肽。在红细胞中，还原型谷胱甘肽是维持血红蛋白处于还原状态的关键，保护细胞免受氧化损伤。谷胱甘肽有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形态，氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG会被谷胱甘肽还原酶还原成GSH，因此机体中大多数是以还原型形式存在。还原型谷胱甘肽是绝大多数活细胞中巯基的主要来源，对于维持蛋白质中巯基适当的氧化还原状态有重要作用，并且是动物细胞中关键的抗氧化剂。

测定细胞内 GSH 和 GSSG含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态，也是谷胱甘肽氧化还原循环的主要指标之一。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测各种生物样本中GSH和GSSG的含量。其原理是GSH能和5,5'-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5'-Dithiobis-2-Nitrobenoicacid，DTNB）反应生成2-硝基-5-巯基苯甲酸，该物质为黄色，在412nm波长处具有最大光吸收，来测定样本中GSH的含量。

通过2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR）将GSSG还原为GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。

产品内容

自备耗材

酶标仪或可见光分光光度计（能测412nm处的吸光度）及恒温箱

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

制冰机、低温离心机、去离子水、匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

提取液：即用型；4℃保存。

GSH反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

GSSG反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂一：即用型；使用前，避光平衡到室温；-20℃避光保存。

试剂二稀释液：使用时，按取试剂二 6µL加水0.12mL的比例配制，整个实验过程中，冰上避光放置。现用现配，用多少配多少；4℃避光保存。

试剂三：使用前96T加1.5mL去离子水，48T加0.75mL去离子水溶解；分装-20℃避光保存。

试剂四：使用时每瓶加入5mL去离子水，4℃避光保存。

标准品制备:

稀释提取液：按1:10的比例用去离子水稀释提取液，如：取500µL 提取液加入4,500µL去离子水。

GSH标准品：

50mM GSH标准品：每管GSH标准品含15.4mg GSH，使用时加1mL稀释后的提取液得50mM GSH标准品，4℃避光保存。

1000µM GSH标准品：取20μL 50mM GSH标准品用 980μL稀释后的提取液稀释。

使用1000µM GSH标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品：

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4h之内使用。

GSSG标准品：

20mM GSSG标准品：取1管标准品，用1mL 稀释后的提取液溶解得20mM GSSG标准品；4℃避光保存。

20µM GSSG标准品：取1μL 20mM GSSG标准品用 999μL稀释后的提取液稀释，使用20µM GSSG标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

动物组织：称取0.1g组织样本，加入1mL预冷的提取液，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，8,000 g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

植物组织：称取0.1g植物组织剪碎，加入1mL预冷的提取液，快速冰上匀浆。匀浆后的样本冰浴超声波破碎

5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。超声后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清

液，置冰上待测。

血清或血浆：按常规方法收集血清，加入等体积的提取液，4℃，8,000g离心10min，取上清液，置冰上待测。将收集的抗凝血于4℃，600g离心10min，30min内吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的提取液，4℃，8,000g离心10min，取上清液，置冰上待测。

血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10min，弃去上层血浆，用PBS重悬，收集5×10⁶个血细胞，用冷PBS清洗2次（用PBS重悬血细胞，4℃ 600g离心10min），加入1mL预冷的提取液，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。超声后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

细胞或细菌：收集5×10⁶个细胞或细菌，首先用冷PBS清洗细胞2次（用PBS重悬细胞，4℃ 600g 离心10min），加入1mL预冷的提取液重悬细胞或细菌，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。超声后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。提取过程中去掉蛋白质，所以提取液不能用于测定蛋白含量。

实验步骤

GSH测定：

1．酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，可见光分光光度计去离子水调零。

2．在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：

充分混匀，37℃避光孵育10min,记录10min时的吸光度A_空、A_标、A_测。计算ΔA_测=A_测-A_空，ΔA_标=A_标-A_空（空白和标准曲线只需测定一次）。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA_测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA_测大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

GSSG测定：

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长至412nm，可见光分光光度计去离子水调零。

2. 试剂二稀释液、试剂三和试剂四37℃保温10min。

3．在EP管中按照如下方式加样：

4．充分混匀，37℃避光孵育10min,记录10min时的吸光度A_空、A_标、A_测。计算ΔA_测=A_测-A_空，ΔA_标=A_标-A_空（空白和标准曲线只需测定一次）。

注意：1. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA_测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA_测大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以最终稀释倍数。

2. 如果样本量过多，可将GSSG反应缓冲液、试剂二稀释液、试剂三与试剂四按照比例混匀配成工作再加入。

结果计算

GSH含量：

1. 标准曲线的绘制

以标准品浓度为y轴，ΔA_标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。

2. GSH含量的计算

将样本的ΔA_测代入方程得到y值（1µM=1nmol/mL）。

（1）按样本鲜重计算

GSH（nmol/g 鲜重）=y×V_样÷(W×V_样÷V_样总)×n=y÷W×n

（2）按液体样本体积计算

GSH（nmol/mL）=2×y×V_样÷V_样×n=2y×n

（3）按细胞数目计算

GSH（nmol/10⁴ cells）=y×V_样÷(500×V_样÷V_样总)×n=y÷500×n=0.002×y×n

V_样：加入样本体积，0.02mL；W：样本质量，0.1g；V_样总：加入提取液体积，1mL；n：样本进一步稀释的稀释倍数；2：液体样本制备时的稀释倍数，加入等体积的提取液即稀释2倍；500：细胞数量，500万。

GSSG含量：

1. 标准曲线的绘制

以标准品浓度为y轴，ΔA_标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。

2. GSSG含量计算

将ΔA_测带入方程得到y值（1µM=1nmol/mL）。

（1）按样本鲜重计算

GSSG（nmol/g 鲜重）=y×V_样÷(W×V_样÷V_样总)×10×n=10y÷W×n

（2）按液体样本体积计算

GSSG（nmol/mL）=2×y×V_样÷V_样×10×n=20y×n

（3）按细胞数目计算

GSSG（nmol/10⁴ cells）=y×V_样÷(500×V_样÷V_样总)×10×n=0.02y×n

V_样：反应中加入样本体积，0.002mL,根据比例折算10µL×(21÷105)=2µL；W：样本质量，g；V_样总：加入提取液体积，1mL；10：样本检测时的稀释倍数,(10+90)÷10；2：液体样本制备时的稀释倍数，加入等体积的提取液即稀释2倍；n：样本进一步稀释的稀释倍数；500：细胞数量，500万。

总谷胱甘肽含量：

总谷胱甘肽=GSH+2×GSSG

2：1个GSSG分子在反应后可以还原成2个GSH分子。

结果展示

典型标准曲线

GSH标准曲线

GSSG标准曲线

注意事项

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。

3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。

5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。

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