产品简介
ATP 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是生物能量通货,能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定 ATP 含量并且计算能荷,能够反映能量代谢状态。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本中ATP的含量活性水平。其原理是肌酸激酶催化肌酸和ATP反应生成磷酸肌酸,可在660nm下用磷钼酸比色法检测磷酸肌酸含量,以此反应ATP含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 粉剂×1支 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 0.75mL | 1.5mL | 4℃保存 |
试剂三 | 30uL | 60uL | -20℃保存 |
试剂四 | 2.5mL | 5mL | -20℃避光保存 |
试剂五 | 12.5mL | 25mL | 4℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测660nm处的吸光度)及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
试剂一:临用前48T加入1.25mL去离子水,96T加入 2.5mL 去离子水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂三:临用前用去离子水进行1:20 稀释,整个实验过程中,冰上避光放置。现用现配,用多少配多少;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂四:即用型;使用前,平衡到室温;-20℃避光保存。
试剂五:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
显色剂的配制:临用前请根据拟用显色剂体积(样本数×0.2mL),按试剂四(mL):试剂五(mL)=1:5的比例配制。用多少配多少。
标准品:临用前加入1mL去离子水得2umol/mL ATP标准液,4℃保存。
样本制备
血浆、血清等液体样本:取约 0.1mL液体样本,加入1mL去离子水充分混匀,100℃加热提取5min,4℃,8,000g离心15min,取上清,置冰上待测。
动植物组织样本:称取约0.1g样本,加入1mL去离子水匀浆,100℃加热提取5min,4℃,8,000g离心15min,取上清,置冰上待测。
细胞或细菌样本:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL去离子水,超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次);然后4℃,8,000g离心15min,取上清,置冰上待测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。
如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上,调节波长至660nm,可见光分光光度计去离子水调零。
2.样本测定(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂):
试剂 | 测定孔(μL) | 标准孔(μL) | 空白孔(μL) |
样本 | 10 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 10 | 0 |
试剂一 | 20 | 20 | 20 |
试剂二 | 10 | 10 | 10 |
试剂三 | 10 | 10 | 10 |
去离子水 | 0 | 0 | 10 |
充分混匀,37℃准确水浴30min | |||
显色剂 | 200 | 200 | 200 |
混匀,37℃水浴20min后,在660nm处,记录各管吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测=A测定-A空白,ΔA标=A标准-A空白。
注意:空白孔和标准孔只需测定一次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量;如果ΔA测大于1.0或测定孔有明显浑浊,样本可用去离子水进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。
结果计算
ATP含量计算:
1.按样本鲜重计算
ATP含量(μmol/g鲜重)=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V样÷(W×V样÷V提取)=2×(ΔA测÷ΔA标)÷W
2.按液体体积计算
ATP含量(μmol/mL)=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V样÷(V液×V样÷V提取)=20×(ΔA测÷ΔA标)
3.按细菌或细胞数量计算
ATP含量(μmol/104 cell)=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V样÷(500×V样÷V提取)=0.004×(ΔA测÷ΔA标)
4.按蛋白浓度计算
ATP含量(μmol/mg prot)=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V样÷(V样÷Cpr)=2×(ΔA测÷ΔA标)÷Cpr
C标:标准液浓度,2μmol/mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V提取:加入提取液体积,1mL;V液:提取时加入液体样本体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。