产品简介
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1-1 糖苷键连接而成的一种非还原双糖,广泛存在于细菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、无脊椎动物和高等植物等多种有机体中。海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等的稳定性。另外,它本身具有很强的吸水性,使它在生物体内具有抗脱水作用,在逆境条件下可保护植物免受不良环境的伤害。植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖,该反应首先在海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)的作用下,催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和 6-磷酸葡萄糖反应生成中间产物6-磷酸海藻糖,再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose 6-phosphate phosphatase,TPP)的作用下去磷酸化,生成海藻糖。因此,测定TPS活性对于研究植物逆境具有重要意义。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的TPS活性检测方法,其原理是:TPS催化UDPG与G6P生成海藻糖-6-磷酸,同时产生UDP;UDP在丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶作用下,氧化NADH为NAD,NADH在340nm下有特征吸收峰,而NAD没有。NADH的下降速率与UDP含量成正比,通过测定340nm吸光度下降速率反映TPS活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×2瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 20μL | 40μL | -20℃避光保存 |
试剂四 | 20μL | 40μL | -20℃保存 |
试剂五 | 25mL | 50mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机,低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
提取液:即用型;4℃保存。
试剂一:临用前48T加入6mL试剂五,96T加入12mL试剂五溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂二:临用前每瓶加入 10mL 试剂五溶解,现配现用。
试剂五:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
工作液的配制:临用前,取溶解后的试剂二一瓶,加入 10μL 试剂三 和 10μL 试剂四,充分混匀,现配现用。
样本制备
组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
细菌或细胞:收集500万细菌或细胞到离心管内,用冷PBS清洗细菌或细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。
2. 试剂一置于30℃水浴10min。
3. 样本测定:在EP依次加入下列试剂
测定(μL) | |
样本 | 100 |
试剂一 | 100 |
混匀,30℃反应20min,95℃水浴2min灭活,冷却至室温。10,000g 4℃离心5min,取上层反应液加入96孔板或微量玻璃比色皿中 | |
反应液 | 20 |
工作液 | 180 |
混匀,室温放置,测定340nm下1min以后的吸光值A1与6min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:1.实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量,注意计算公式中调整样品质量;如果ΔA大于0.5,可用提取液稀释样品,计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在对应温度。
3. 因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本)。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织产生的UDP在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPS(U/g 鲜重)= [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×10=1286×ΔA÷W
2)按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞产生的UDP在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPS(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T×10=2.57×ΔA
3)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白产生的UDP在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPS(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T×10=1286×ΔA÷Cpr
V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;10:反应时样本稀释倍数,(100+100)/20=10;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。