产品简介
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1-1 糖苷键连接而成的一种非还原双糖，广泛存在于细菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、无脊椎动物和高等植物等多种有机体中。海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等的稳定性。另外，它本身具有很强的吸水性，使它在生物体内具有抗脱水作用，在逆境条件下可保护植物免受不良环境的伤害。植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖，该反应首先在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-磷酸葡萄糖反应生成中间产物6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶（trehalose 6-phosphate phosphatase，TPP）的作用下去磷酸化，生成海藻糖。因此，测定TPS活性对于研究植物逆境具有重要意义。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的TPS活性检测方法，其原理是：TPS催化UDPG与G6P生成海藻糖-6-磷酸，同时产生UDP；UDP在丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶作用下，氧化NADH为NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，而NAD没有。NADH的下降速率与UDP含量成正比，通过测定340nm吸光度下降速率反映TPS活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×2瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 20μL | 40μL | -20℃避光保存 |
试剂四 | 20μL | 40μL | -20℃保存 |
试剂五 | 25mL | 50mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机，低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：临用前48T加入6mL试剂五，96T加入12mL试剂五溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂二：临用前每瓶加入 10mL 试剂五溶解，现配现用。
试剂五：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液的配制：临用前，取溶解后的试剂二一瓶，加入 10μL 试剂三 和 10μL 试剂四，充分混匀，现配现用。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细菌或细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。
2. 试剂一置于30℃水浴10min。
3. 样本测定：在EP依次加入下列试剂
测定（μL） | |
样本 | 100 |
试剂一 | 100 |
混匀，30℃反应20min，95℃水浴2min灭活，冷却至室温。10,000g 4℃离心5min，取上层反应液加入96孔板或微量玻璃比色皿中 | |
反应液 | 20 |
工作液 | 180 |
混匀，室温放置，测定340nm下1min以后的吸光值A1与6min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：1.实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量，注意计算公式中调整样品质量；如果ΔA大于0.5，可用提取液稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在对应温度。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织产生的UDP在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPS（U/g 鲜重）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×10=1286×ΔA÷W
2）按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞产生的UDP在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPS（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T×10=2.57×ΔA
3）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白产生的UDP在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPS（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T×10=1286×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；10：反应时样本稀释倍数，（100+100）/20=10；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
