产品简介
S-CAT是土壤微生物代谢的重要酶类，在H2O2清除系统中具有重要作用。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于分析土壤样本中的过氧化氢酶活性，其原理是利用过氧化氢酶的过氧化物酶功能来测定过氧化氢酶的活性。在合适浓度的H2O2存在的条件下，土壤过氧化氢酶与甲醇反应，产生甲醛，生成的甲醛可以与显色物反应，产物可以在540nm处测量吸光度，S-CAT活性与OD值成正比。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
反应缓冲液 (10×) | 5mL | 10mL | 4℃ |
试剂一 | 2mL | 4mL | 4℃ |
试剂二 | 2mL | 4mL | 4℃ |
试剂三 | 0.5mL | 1mL | -20℃ |
试剂四 | 2mL | 4mL | -20℃避光保存 |
试剂五 | 1mL | 2mL | 4℃ |
甲醛标准品 (4M) | 100μL | 100μL | 4℃ |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测540nm处的吸光值）及恒温培养箱或水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
台式离心机、30-50目筛
去离子水
试剂准备
反应缓冲液 (1×): 反应缓冲液 (10×)去离子水 1:10 稀释后（2mL 10×反应缓冲液+18mL去离子水），可在4℃保存至少两个月。
试剂一: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三: 用 9.96mL去离子水稀释40µL 试剂三。稀释后的试剂三溶液可保存4h。
试剂四: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂五: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
标准品制备：用 9.99mL 去离子水稀释10µL甲醛标准品 (4M)，得到4mM的储存液。按下表所示，进一步稀释标准品。
标准品编号 | 标准品体积 (µL) | 去离子水体积 (µL) | 标准品浓度 (mM） |
标准品1 | 40µL of 4mM | 320 | 0.4 |
标准品2 | 200µL of 标准品1 | 200 | 0.2 |
标准品3 | 200µL of 标准品2 | 200 | 0.1 |
标准品4 | 200µL of 标准品3 | 200 | 0.05 |
标准品5 | 200µL of 标准品4 | 200 | 0.025 |
标准品6 | 200µL of 标准品5 | 200 | 0.0125 |
标准品7 | 200µL of 标准品6 | 200 | 0.00625 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
新鲜土样自然风干或 37℃烘箱风干，过30-50目筛。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2.样本测定（在EP管中加入下列试剂）：
试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
风干土样（g） | 0.02 | 0.02 | 0 | 0 |
1×反应缓冲液（μL） | 100 | 100 | 0 | 0 |
试剂一（μL） | 30 | 30 | 0 | 0 |
去离子水（μL） | 0 | 20 | 0 | 0 |
稀释后的试剂三 | 20 | 0 | 0 | 0 |
充分混匀，室温孵育20min，8000g 25℃离心10min，取上清液到新的EP管中 | ||||
上清液（μL） | 100 | 100 | 0 | 0 |
标准品（μL） | 0 | 0 | 100 | 0 |
去离子水（μL） | 0 | 0 | 0 | 100 |
试剂二（μL） | 30 | 30 | 30 | 30 |
试剂四（μL） | 30 | 30 | 30 | 30 |
充分混匀，室温孵育10min | ||||
试剂五（μL） | 10 | 10 | 10 | 10 |
充分混匀，室温孵育5min，4,000g 25℃离心10min，取100μL于96孔板或微量玻璃比色皿，测定540nm处的吸光值A。计算ΔA测=A测定-A对照，ΔA标=A标准-A空白。
注意：每个测定管需设一个对照，标准曲线和空白只需要测一次。
实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA测大于2.0，可减少样本量进行检测，结果计算时调整样本质量；如果ΔA测小于0.005，可增加样本量进行检测，结果计算时调整样本质量。
结果计算
1. 标准曲线绘制：
以甲醛标准溶液终浓度(mM)为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将样本的ΔA测代入方程得到y值（1mM=1mmol/L=1μmol/mL）。
2. 样本S-CAT活性计算
单位的定义：每天每g风干土样催化产生1μmol 甲醛定义为一个酶活力单位U。
S-CAT（U/g）＝y×V反总÷W÷T=10.8y÷W
V反总：反应体系总体积，0.15mL；T：反应时间，20min=1/72d；W：样品质量，0.02g。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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