土壤硝酸还原酶（S-NR）测试盒 - 土壤系列 - 产品展示 - 武汉普美克生物技术有限公司

产品简介

S-NR催化土壤中硝酸盐还原为亚硝酸盐，是土壤硝态氮还原的关键酶。研究S-NR的活性对合理施肥，降低氮素的损失具有重要意义。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测土壤硝酸还原酶（S-NR）。其原理是 S-NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ+NADH+H^＋→ NO2ˉ+NAD^＋+H₂O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α- 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，测定540nm处的吸光值的增加，可以反映S-NR活性。

产品内容

试剂盒组分	规格		储存条件
试剂盒组分	48T	96T	储存条件
试剂一	6mL	12mL	-20℃保存
试剂二	4.5mL	9mL	-20℃保存
试剂三	5mL	10mL	4℃，避光保存
试剂四	5mL	10mL	4℃，避光保存
标准品（1M NaNO₂）	1mL	1mL	-20℃，避光保存

自备耗材

酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光值）、烘箱、水浴锅

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

台式离心机、30-50目筛

去离子水

试剂准备

试剂一：即用型；使用前平衡到室温；-20℃保存。

试剂二：即用型；使用前平衡到室温；-20℃保存。

试剂三：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光4℃保存。

试剂四：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光 4℃保存。

标准曲线设置：取10µL NaNO₂ 标准品（1M）用 990µL去离子水稀释至10mM NaNO₂。取10µL 10mM 的NaNO₂ 用 990µL去离子水稀释至100µM NaNO₂。用100µM NaNO₂按下表所示，进行下一步稀释：

	标准品体积 (µL)	去离子水体积(μL)	浓度 (µM)
Std.1	400µL 100µM NaNO₂	0	100
Std.2	200µL of Std.1	200	50
Std.3	200µL of Std.2	200	25
Std.4	200µL of Std.3	200	12.5
Std.5	200µL of Std.4	200	6.25
Std.6	200µL of Std.5	200	3.13
Std.7	200µL of Std.6	200	1.56

注意：标准品现配现用；稀释后的标准溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30-50目筛。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。

2.样本测定（在EP管中加入下列试剂）：

试剂名称	测定管	对照管	标准管	空白管
风干土样（g）	0.06	0.06	0	0
试剂一（μL）	225	225	0	0
试剂二（μL）	75	0	0	0
混匀后，盖盖后37℃水浴24h，8000g 25℃离心10min，取上清液到新的EP管中
上清液（μL）	130	130	0	0
标准液（μL）	0	0	130	0
去离子水（μL）	0	0	0	130
试剂三（μL）	85	85	85	85
试剂四（μL）	85	85	85	85

混匀，25℃水浴显色20min，4000g 25℃离心10min，取200μL于96孔板或微量玻璃比色皿，测定540nm处的吸光值。计算ΔA_测=A_测定-A_对照_，ΔA_标=A_标准-A_空白。每个测定管需设一个对照，标准曲线和空白只需要测一次。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA_测小于0.005可适当加大样本量。如果样本吸光值大于1.5，样本上清液可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少样本量。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为y轴，ΔA_标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将样本的ΔA_测代入方程得到y值（1μM=1μmol/L=1×10^-3μmol/mL）。

2. S-NR活性计算：

单位的定义：每天每g土样在反应体系中产生1μmol NO₂ˉ的量为一个S-NR活力单位。

S-NR（U/g土样）=y×10^-3×V_反总÷W÷T =0.005y

V_反总：反应体系总体积，0.3mL；T：反应时间，24h，1d；W：样本质量，0.06g。

结果展示

典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。