产品简介
土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）是反硝化作用中的关键酶之一，它是由土壤反硝化细菌产生的一种还原酶类，参与亚硝酸盐至NO的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测土壤亚硝酸还原酶（S-NiR）。其原理是亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰。亚硝酸还原酶可将亚硝酸盐还原为NO，使样本中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2-减少，即540nm处吸光值减少。通过测定540nm处的吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 2mL | 4mL | -20℃，避光保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 2mL | 4mL | 4℃保存 |
试剂四 | 5mL | 10mL | 4℃，避光保存 |
试剂五 | 5mL | 10mL | 4℃，避光保存 |
标准品（1M NaNO2） | 1mL | 1mL | -20℃，避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光值）、烘箱、水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
台式离心机、30-50目筛
去离子水
试剂准备
试剂一：即用型；使用前平衡到室温；-20℃避光保存。
试剂二：临用前48T加2mL去离子水，96T加4mL去离子水溶解；4℃保存一个月或分装-20℃长期保存。
试剂三：即用型；使用前平衡到室温；4℃保存。如出现沉淀可以70-80℃加热溶解
试剂四：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光4℃保存。
试剂五：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光4℃保存。
工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。
标准品：含1M NaNO2，使用前平衡到室温；分装-20℃避光保存。
标准曲线设置：取10µL NaNO2 标准品（1M）用 990µL去离子水稀释至10mM NaNO2。取10µL 10mM 的NaNO2 用 990µL去离子水稀释至100µM NaNO2。用100µM NaNO2按下表所示，进行下一步稀释：
标准品体积 (µL) | 去离子水体积(μL) | 浓度 (µM) | |
Std.1 | 400µL 100µM NaNO2 | 0 | 100 |
Std.2 | 200µL of Std.1 | 200 | 50 |
Std.3 | 200µL of Std.2 | 200 | 25 |
Std.4 | 200µL of Std.3 | 200 | 12.5 |
Std.5 | 200µL of Std.4 | 200 | 6.25 |
Std.6 | 200µL of Std.5 | 200 | 3.13 |
Std.7 | 200µL of Std.6 | 200 | 1.56 |
注意：标准品现配现用；稀释后的标准溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备
新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30-50目筛。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2.样本测定（在EP管中操作）：
试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
风干土样（g） | 0.02 | 0.02 | 0 | 0 |
试剂一（μL） | 40 | 40 | 0 | 0 |
试剂二（μL） | 40 | 0 | 0 | 0 |
混匀后，25℃反应1h | ||||
试剂三（μL） | 40 | 40 | 0 | 0 |
充分震荡30S，10000rpm，4℃，离心10min，取上清液加入96孔板或微量玻璃比色皿中 | ||||
上清液（μL） | 70 | 70 | 0 | 0 |
标准液（μL） | 0 | 0 | 70 | 0 |
去离子水（μL） | 0 | 0 | 0 | 70 |
工作液（μL） | 140 | 140 | 140 | 140 |
充分混匀，37℃孵育30min后测定540nm处吸光值，计算ΔA测=A对照-A测定，ΔA标=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照，标准曲线和空白只需要测一次。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将样本的ΔA测代入方程得到y值（1μM=1μmol/L=1×10-3μmol/mL）。
2. S-NiR活性计算：
单位的定义：每天每g土样在反应体系中还原1μmol NO2ˉ 的量为一个酶活力单位U。
S-NiR（U/g土样）=y×10-3×V反总÷W÷T=0.144y
V反总：反应体系总体积，0.12mL；T：反应时间，1h=1/24d；W：样本质量，0.02g。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
PMK1825 土壤硝酸还原酶（S-NR）检测试剂盒（微量法）
PMK1819 土壤脲酶（S-UE)检测试剂盒（微量法）
PMK1826 土壤蔗糖酶(S-SC)检测试剂盒（微量法）
PMK1829 土壤碱性磷酸酶（S-AKP/ALP）检测试剂盒（微量法）
