产品简介
活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，研究表明，机体95％以上的活性氧（ROS）都来自于线粒体，其失衡所致的氧化应激与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程有关。正常情况下，细胞内抗氧化防御系统与氧自由基处于平衡状态，细胞内活性氧（ROS）水平维持在较低的生理范围；在病理情况下，细胞内抗氧化系统与氧自由基的平衡被打破，细胞内活性氧水平过多，就可破坏线粒体酶类、脂类和核酸，使机体出现氧化应激，同时，活性氧还可攻击线粒体DNA产生氧化损伤，导致线粒体ATP合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变化。因此，通过检测活性氧的变化来判断线粒体的功能是否正常具有重要意义。本试剂盒提供了一荧光测定法，用于直接定量检测线粒体 ROS产生速率。其原理是荧光探针-还原型二氯荧光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluores cin diacetate, DCFH-DA)可扩散通过线粒体膜，在线粒体内被酯酶水解，形成无荧光的DCFH，DCFH 迅速与ROS反应生成荧光物—氧化型二氯荧光素(2', 7'-dichlo rofluorescin,DCF)。将荧光强度随时间变化的数据点拟合，线性回归直线斜率与ROS产生的速率呈正比。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 60mL | 120mL | 4℃保存 |
试剂二 | 25mL | 50mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | -20℃避光保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂六 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂七 | 25μL | 50μL | -20℃避光保存 |
自备耗材
荧光酶标仪或多功能酶标仪、恒温培养箱、分析天平
全黑96孔板、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器或研钵
试剂准备
注意：小管试剂开盖前，请先低速离心。
试剂一：即用型；4℃保存。
试剂二：即用型；4℃保存。
试剂三：即用型；4℃保存。
试剂四：临用前48T加入3mL试剂二；96T加入6mL试剂二充分溶解；4℃保存。
试剂五：临用前48T加入3mL试剂二；96T加入6mL试剂二充分溶解；4℃保存。
试剂六：临用前48T加入3mL试剂二；96T加入6mL试剂二充分溶解；4℃保存。
试剂七：临用前用试剂二稀释300倍后使用；根据样本数量计算需要的量，现用现配；-20℃避光保存。
样本制备
线粒体提取：
1. 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2. 将上述匀浆液于600g，4℃离心5min。
3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4. 弃上清，沉淀中加入200μL 试剂二重悬。
注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 荧光酶标仪或多功能酶标仪预热30min以上，调节激发光499nm，发射光521nm。
2. 样本测定（在全黑96孔板中依次加入下列试剂）：
试剂名称 | 测定孔（μL） | 空白孔（μL） |
样本线粒体悬液 | 20 | 0 |
试剂二 | 0 | 20 |
试剂四 | 50 | 50 |
试剂五 | 50 | 50 |
试剂六 | 50 | 50 |
试剂七 | 30 | 30 |
充分混匀，37℃避光孵育15min。孵育完成后，在37℃测定10min内的荧光强度，激发波长499nm，发射波长521nm，记录10min内荧光值变化。空白孔只需做1个
结果计算
ROS产生速率计算：
对采样数据点即荧光强度随时间的变化进行线性回归拟合处理,计算出回归系数,即直线斜率（k）。实际线粒体ROS产生速率等于样本荧光强度随时间变化的数据点线性回归直线斜率(k测定)减去本底荧光强度随时间变的数据点线性回归直线斜率（k空白）。
1. 按样本鲜重计算：每g组织线粒体每秒钟荧光单位的变化,即 u/s/g 鲜重
ROS 产生速率(u/s/g 鲜重)=(k测定-k空白)/(V样÷V总×W）=10×(k测定-k空白)÷W
2. 按样本蛋白浓度计算：每毫克蛋白线粒体每秒钟荧光单位的变化，即 u/s/mg prot
ROS 产生速率(u/s/mg prot)=(k测定-k空白)/(V样÷V总×Cpr）=10×(k测定-k空白)÷Cpr
V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：悬液体积，0.2mL；W:样本鲜重，g；Cpr: 样本蛋白浓度，mg/mL。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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