产品简介
β-羟基丁酸(β-HB;3-羟基丁酸)是酮体（或含有酮基的水溶性分子）的一种，主要在肝脏中由脂肪酸氧化产生，并输出到外周组织，作为能量来源。脂肪酸在肝内正常分解代谢后所产生的酮体，分为乙酰乙酸，β-羟基丁酸和丙酮。这三类物质互相转换，性质大致相同，但代谢途径却不一样。β-HB和乙酰乙酸将能量从肝脏输送到其他组织。β-羟基丁酸占酮体总量的78%，主要存在于血液中。乙酰乙酸占酮体总量的20%，可以由尿液排出，也可转变为丙酮呼出。丙酮占酮体总量的2%，容易挥发，可通过呼吸尿液等排出体外。β-HB可在食物摄入量少、低碳水化合物饮食、高脂肪饮食、饥饿和长期剧烈运动期间产生。β-羟基丁酸的测定在糖尿病酮症的诊断、治疗监测中比乙酰乙酸测定更灵敏，更可靠，同样在糖尿病控制的预告中也非常有价值。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于分析各种生物样品中β-HB含量。其原理是β-HB被β-羟丁酸脱氢酶（β-HBDH）氧化，产生乙酰乙酸，伴随这个反应过程，NAD+被还原为NADH，NADH将WST-8还原生成橙黄色formazan（甲臜），在450nm左右检测有最大吸收峰。通过测定450nm下吸光度变化来计算β-HB含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
反应缓冲液 | 60mL | 120mL | 4℃ |
试剂一 | 30μL | 60μL | -20℃ |
试剂二 | 0.5mL | 1mL | -20℃ |
试剂三 | 300μL | 600μL | 4℃，避光保存 |
试剂四 | 60μL | 120μL | 4℃，避光保存 |
β-HB标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃ |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测450nm处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一: 使用时，用反应缓冲液进行 1:20稀释，整个实验过程中，冰上避光放置。现用现配，用多少配多少；保存于-20℃。
试剂二: 即用型；整个实验过程中，冰上放置；分装保存于-20℃。
试剂三: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；4℃，避光保存。
试剂四: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；4℃，避光保存。
工作液：每孔准备85µL工作液，现配现用：吸取61µL反应缓冲液，8µL试剂二, 5µL试剂三, 1µL试剂四和10μL稀释后的试剂一混合均匀。
β-HB标准品：含10mgβ-HB，临用前加0.793mL反应缓冲液得100mM标准品，分装保存于-20℃。取100mM标准品用反应缓冲液1:50稀释，建议取10μL 100mM标准品，加490μL反应缓冲液稀释至2mM，混合均匀。
标准曲线设置：按下表所示，用反应缓冲液将2mM标准品稀释为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313 mM的标准溶液。
标准品体积（µL） | 反应缓冲液体积（µL） | 标准品浓度（mM） | |
Std.1 | 400µL 2mM | 0 | 2 |
Std.2 | 200µL of Std.1 | 200 | 1 |
Std.3 | 200µL of Std.2 | 200 | 0.5 |
Std.4 | 200µL of Std.3 | 200 | 0.25 |
Std.5 | 200µL of Std.4 | 200 | 0.125 |
Std.6 | 200µL of Std.5 | 200 | 0.0625 |
Std.7 | 200µL of Std.6 | 200 | 0.0313 |
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL反应缓冲液，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入1mL 反应缓冲液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后12,000 g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清、血浆等液体样本：可直接用来检测，或者如果有必要，建议将样本根据预实验结果用反应缓冲液稀释后再进行检测。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存6个月。大多数样本含有内源性β-羟丁酸脱氢酶（β-HBDH）可降解β-HB，制备好的样本应尽快检测，或通过10kDa MW 离心式过滤器（超滤管）过滤，取滤液，以去除所有蛋白质，然后-80℃保存。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：
试剂（μL） | 空白孔 | 标准孔 | 测定孔 | 对照孔 |
样本 | 0 | 0 | 20 | 20 |
标准品 | 0 | 20 | 0 | 0 |
反应缓冲液 | 20 | 0 | 0 | 0 |
工作液 | 80 | 80 | 80 | 0 |
反应缓冲液 | 0 | 0 | 0 | 80 |
3. 混匀后，37℃避光孵育30min，测定450nm处吸光度，空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测，对照孔记为A对。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空（空白和标准曲线只需做1次）。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测大于2.0，样本可用反应缓冲液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
2. 含量的计算
将样本的ΔA测代入方程得到y值（1mM=1μmol/mL）。
（1）按样本鲜重计算
β-HB含量（μmol/g 鲜重）=y×V样÷(W×V样÷V样总) ×n=y÷W×n
（2）按样本体积计算
β-HB含量（μmol/mL）=y×V样÷V样×n=y×n
（3）按细胞数目计算
β-HB含量（μmol/104 cells）=y×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)×n=y÷500×n=0.002×y×n
V样：加入样本体积，0.05mL；W：样本质量，g；V样总：加入反应缓冲液体积，1mL；n：样本稀释倍数； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞数量，500万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
