产品简介
β-羟基丁酸(β-HB;3-羟基丁酸)是酮体(或含有酮基的水溶性分子)的一种,主要在肝脏中由脂肪酸氧化产生,并输出到外周组织,作为能量来源。脂肪酸在肝内正常分解代谢后所产生的酮体,分为乙酰乙酸,β-羟基丁酸和丙酮。这三类物质互相转换,性质大致相同,但代谢途径却不一样。β-HB和乙酰乙酸将能量从肝脏输送到其他组织。β-羟基丁酸占酮体总量的78%,主要存在于血液中。乙酰乙酸占酮体总量的20%,可以由尿液排出,也可转变为丙酮呼出。丙酮占酮体总量的2%,容易挥发,可通过呼吸尿液等排出体外。β-HB可在食物摄入量少、低碳水化合物饮食、高脂肪饮食、饥饿和长期剧烈运动期间产生。β-羟基丁酸的测定在糖尿病酮症的诊断、治疗监测中比乙酰乙酸测定更灵敏,更可靠,同样在糖尿病控制的预告中也非常有价值。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法,用于分析各种生物样品中β-HB含量。其原理是β-HB被β-羟丁酸脱氢酶(β-HBDH)氧化,产生乙酰乙酸,伴随这个反应过程,NAD+被还原为NADH,NADH将WST-8还原生成橙黄色formazan(甲臜),在450nm左右检测有最大吸收峰。通过测定450nm下吸光度变化来计算β-HB含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
反应缓冲液 | 60mL | 120mL | 4℃ |
试剂一 | 30μL | 60μL | -20℃ |
试剂二 | 0.5mL | 1mL | -20℃ |
试剂三 | 300μL | 600μL | 4℃,避光保存 |
试剂四 | 60μL | 120μL | 4℃,避光保存 |
β-HB标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃ |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测450nm处的吸光度)
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
反应缓冲液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一: 使用时,用反应缓冲液进行 1:20稀释,整个实验过程中,冰上避光放置。现用现配,用多少配多少;保存于-20℃。
试剂二: 即用型;整个实验过程中,冰上放置;分装保存于-20℃。
试剂三: 即用型;整个实验过程中,冰上避光放置;4℃,避光保存。
试剂四: 即用型;整个实验过程中,冰上避光放置;4℃,避光保存。
工作液:每孔准备85µL工作液,现配现用:吸取61µL反应缓冲液,8µL试剂二, 5µL试剂三, 1µL试剂四和10μL稀释后的试剂一混合均匀。
β-HB标准品:含10mgβ-HB,临用前加0.793mL反应缓冲液得100mM标准品,分装保存于-20℃。取100mM标准品用反应缓冲液1:50稀释,建议取10μL 100mM标准品,加490μL反应缓冲液稀释至2mM,混合均匀。
标准曲线设置:按下表所示,用反应缓冲液将2mM标准品稀释为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313 mM的标准溶液。
标准品体积(µL) | 反应缓冲液体积(µL) | 标准品浓度(mM) | |
Std.1 | 400µL 2mM | 0 | 2 |
Std.2 | 200µL of Std.1 | 200 | 1 |
Std.3 | 200µL of Std.2 | 200 | 0.5 |
Std.4 | 200µL of Std.3 | 200 | 0.25 |
Std.5 | 200µL of Std.4 | 200 | 0.125 |
Std.6 | 200µL of Std.5 | 200 | 0.0625 |
Std.7 | 200µL of Std.6 | 200 | 0.0313 |
样本制备
组织:称取约0.1g样本,加入1mL反应缓冲液,冰浴匀浆,12,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞或细菌,离心后弃上清,加入1mL 反应缓冲液,冰浴超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后12,000 g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
血清、血浆等液体样本:可直接用来检测,或者如果有必要,建议将样本根据预实验结果用反应缓冲液稀释后再进行检测。
注意:建议使用新鲜样本。如果不立即使用,可将样品在-80℃下保存6个月。大多数样本含有内源性β-羟丁酸脱氢酶(β-HBDH)可降解β-HB,制备好的样本应尽快检测,或通过10kDa MW 离心式过滤器(超滤管)过滤,取滤液,以去除所有蛋白质,然后-80℃保存。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上,调节波长到450nm,可见光分光光度计去离子水调零。
2. 操作表(下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作):
试剂(μL) | 空白孔 | 标准孔 | 测定孔 | 对照孔 |
样本 | 0 | 0 | 20 | 20 |
标准品 | 0 | 20 | 0 | 0 |
反应缓冲液 | 20 | 0 | 0 | 0 |
工作液 | 80 | 80 | 80 | 0 |
反应缓冲液 | 0 | 0 | 0 | 80 |
3. 混匀后,37℃避光孵育30min,测定450nm处吸光度,空白孔记为A空,标准孔记为A标,测定孔记为A测,对照孔记为A对。计算ΔA测=A测-A对,ΔA标=A标-A空(空白和标准曲线只需做1次)。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测大于2.0,样本可用反应缓冲液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为y轴,ΔA标为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。
2. 含量的计算
将样本的ΔA测代入方程得到y值(1mM=1μmol/mL)。
(1)按样本鲜重计算
β-HB含量(μmol/g 鲜重)=y×V样÷(W×V样÷V样总) ×n=y÷W×n
(2)按样本体积计算
β-HB含量(μmol/mL)=y×V样÷V样×n=y×n
(3)按细胞数目计算
β-HB含量(μmol/104 cells)=y×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)×n=y÷500×n=0.002×y×n
V样:加入样本体积,0.05mL;W:样本质量,g;V样总:加入反应缓冲液体积,1mL;n:样本稀释倍数; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;500:细胞数量,500万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。