糖异生系列

丙酮酸羧化酶(PC)检测试剂盒(定磷法/微量法)

货号:PMK1885
规格:48T/96T
价格:720元/1200元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC,EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中,但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,是糖异生过程的第一个限速酶,在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。试剂盒提供了一种简单的检测方法,用于检测生物样本中PC的活性。其原理是PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,通过测定Pi增加速率来反映PC活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

提取液

50mL

100mL

4℃保存

试剂一

9mL

18mL

4℃保存

试剂二

粉剂×1

粉剂×1

-20℃保存

试剂三

粉剂×1

粉剂×1

4保存

试剂四

粉剂×1

粉剂×1

4保存

试剂五

粉剂×1

粉剂×1

4保存

试剂六

5mL

10mL

室温保存

标准品

1mL

1mL

4保存

自备耗材

酶标仪或分光光度计(能测660nm处的吸光度)及水浴锅

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

低温离心机、制冰机

去离子水

匀浆器

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

提取液即用型;4℃保存。

试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂二:临用前在试剂四瓶中48T加入0.5mL去离子水,96T加入1mL去离子水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。

试剂三:临用前配制,48T加入2mL去离子水充分溶解,96T加入4mL去离子水充分溶解后使用。

试剂四:临用前配制,48 T加入5mL去离子水充分溶解,96T加入10mL去离子水充分溶解后使用。

试剂五:临用前配制,48 T加入5mL去离子水充分溶解,96 T加入10mL去离子水充分溶解后使用。

试剂六:即用型;室温保存。

定磷试剂的配制:配制比例按照H2O : 试剂四: 试剂五: 试剂六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。

注意:配试剂最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

标准曲线设置按下表所示用去离子水将10mM 标准品稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM 的标准溶液。


标准品体积(µL)

去离子水体积(µL)

标准品浓度(mM)

Std.1

100µL 10mM

900

1

Std.2

100µL of Std.1 (1mM)

100

0.5

Std.3

100µL of Std.2 (0.5mM)

100

0.25

Std.4

100µL of Std.3 (0.25mM)

100

0.125

Std.5

100µL of Std.4 (0.125mM)

100

0.0625

Std.6

100µL of Std.5 (0.0625mM)

100

0.0313

Std.7

100µL of Std.6 (0.0313mM)

100

0.0156

样本制备

组织、菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1. 称取约0.1g组织或收集500万菌或细胞,加入1mL提取液,冰浴匀浆。

2. 将匀浆600g,4℃离心5min。

3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

4. 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的PC(此步可选做)。

5. 在步骤4的沉淀中加入1mL提取液,超声波破碎5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),用于线粒体PC活性测定

注意:1. 推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂进行样本蛋白质浓度测定。

2. 对于脂肪含量较高的动物组织,离心后移除上层脂肪,再取上清液。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到660nm可见分光光度计去离子水调零。

2. 酶促反应(在EP管中依次加入下列试剂):


空白管(μL)

标准管(μL)

测定管(μL)

对照管(μL)

试剂一

0

0

180

180

试剂二

0

0

10

10

样本

0

0

10

0

混匀后盖紧,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确孵育30min

试剂三

0

0

20

20

样本

0

0

0

10

混匀后,室温(25左右),4,000g,离心10min,取上清液;

3. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂)

上清

0

0

40

40

不同浓度标准品

0

40

0

0

去离子水

40

0

0

0

定磷试剂

200

200

200

200

混匀,室温静置10min后,测定660nm吸光值。计算ΔA=A测定-A对照ΔA=A标准-A空白。(空白管只需做 1 管)

4. 注意:为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于1.5)可用试剂二稀释样本后再测定,计算结果时注意乘以稀释倍数。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准液浓度为y轴,ΔAx轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。

2. 无机磷(Pi)含量的计算

∆A带入方程得到y值(mM)。

3. PC活性计算

1)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U。

上清中PC活性的计算:

PC上清活性(U/g 鲜重)= (y上清×V酶促×106)÷(V÷V提取×W)÷T=666.67×y上清÷W

沉淀中PC活性的计算:

PC沉淀活性(U/g 鲜重)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V÷V重悬×W)÷T=666.67×y沉淀÷W

样本PC总活性的计算:

样本PC总活性即为上清中PC活性与沉淀中PC活性之和。

按样本鲜重计算:PC总活性(U/g 鲜重)=666.67×y上清÷W+ 666.67×y沉淀÷W

=666.67×y上清+y沉淀÷W

2)按细胞数量计算

单位的定义:每1万个细胞每分钟产生1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位U。

上清中PC活性的计算:

PC上清活性(U/104 cell)= (y上清×V酶促×106)÷(V÷V提取×500)÷T=1.33×y上清

沉淀中PC活性的计算:

PC沉淀活性(U/104 cell)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V÷V重悬×500)÷T=1.33×y沉淀

样本PC总活性的计算:

样本PC总活性即为上清中PC活性与沉淀中PC活性之和。

按细胞数量计算:PC总活性(U/104 cell)=1.33×y上清+1.33×y沉淀=1.33×y上清+y沉淀

(3)按样本蛋白浓度

单位的定义:每毫克组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U。

上清中PC活性的计算:

PC上清活性(U/mg prot)= (y上清×V酶促×106Cpr×V)÷T=666.67×y上清÷Cpr

沉淀中PC活性的计算:

PC沉淀活性(U/mg prot)=(y沉淀×V酶促×106)÷(Cpr×V)÷T=666.67×y沉淀÷Cpr

样本PC总活性的计算:

样本PC总活性即为上清中PC活性与沉淀中PC活性之和。

按样本鲜重计算:PC总活性(U/g 鲜重)=666.67×y上清÷Cpr+ 666.67×y沉淀÷Cpr

=666.67×y上清+y沉淀÷Cpr

V酶促:酶促反应体系总体积,2×10-4L;106:单位换算系数,1mmol=106nmol;V:加入样本体积,0.01mL;T:反应时间,30min;V提取:提取体系体积,1mL ;W:样本重量,g;V重悬:重悬沉淀体积,1mL;500:细胞总数,500万Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL

结果展示

典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线

                               


 image


注意事项

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。



相关产品:

PMK1116 丙酮酸(PA)检测试剂盒(微量法)

PMK1006 丙酮酸脱羧酶(PDC)检测试剂盒(微量法)

PMK1121 丙酮酸激酶(PK)检测试剂盒(微量法)

PMK1123 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)检测试剂盒(微量法)


SIGNUP FOR OUR NEWSLETTER
Subscribe free newsletter to get latest products and discount information.

武汉普美克生物技术有限公司 © All Rights Reserved. 地址:武汉市东湖高新区自贸生物创新港B区N803-804

电话:400-0698-668  手机:  Email:bioprimacy@aliyun.com

鄂ICP备17001029号-1