产品简介
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。它是供给草酰乙酸的主要补充反应，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖异生过程的第一个限速酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本中PC的活性。其原理是PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来反映PC活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 9mL | 18mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
试剂六 | 5mL | 10mL | 室温保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计（能测660nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前在试剂四瓶中48T加入0.5mL去离子水，96T加入1mL去离子水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂三：临用前配制，48T加入2mL去离子水充分溶解，96T加入4mL去离子水充分溶解后使用。
试剂四：临用前配制，48 T加入5mL去离子水充分溶解，96T加入10mL去离子水充分溶解后使用。
试剂五：临用前配制，48 T加入5mL去离子水充分溶解，96 T加入10mL去离子水充分溶解后使用。
试剂六：即用型；室温保存。
定磷试剂的配制：配制比例按照H2O : 试剂四: 试剂五: 试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
标准曲线设置：按下表所示用去离子水将10mM 标准品稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM 的标准溶液。
标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（mM） | |
Std.1 | 100µL 10mM | 900 | 1 |
Std.2 | 100µL of Std.1 (1mM) | 100 | 0.5 |
Std.3 | 100µL of Std.2 (0.5mM) | 100 | 0.25 |
Std.4 | 100µL of Std.3 (0.25mM) | 100 | 0.125 |
Std.5 | 100µL of Std.4 (0.125mM) | 100 | 0.0625 |
Std.6 | 100µL of Std.5 (0.0625mM) | 100 | 0.0313 |
Std.7 | 100µL of Std.6 (0.0313mM) | 100 | 0.0156 |
样本制备
组织、真菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1. 称取约0.1g组织或收集500万真菌或细胞，加入1mL提取液，冰浴匀浆。
2. 将匀浆液600g，4℃离心5min。
3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做）。
5. 在步骤4的沉淀中加入1mL提取液，超声波破碎5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），用于线粒体PC活性测定。
注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
2. 对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 酶促反应（在EP管中依次加入下列试剂）：
空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） | 对照管（μL） | |
试剂一 | 0 | 0 | 180 | 180 |
试剂二 | 0 | 0 | 10 | 10 |
样本 | 0 | 0 | 10 | 0 |
混匀后盖紧，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确孵育30min | ||||
试剂三 | 0 | 0 | 20 | 20 |
样本 | 0 | 0 | 0 | 10 |
混匀后，室温（25℃左右），4,000g，离心10min，取上清液； | ||||
3. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂） | ||||
上清 | 0 | 0 | 40 | 40 |
不同浓度标准品 | 0 | 40 | 0 | 0 |
去离子水 | 40 | 0 | 0 | 0 |
定磷试剂 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀，室温静置10min后，测定660nm吸光值。计算ΔA测=A测定-A对照，ΔA标=A标准-A空白。（空白管只需做 1 管） | ||||
4. 注意：为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5）可用试剂二稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
2. 无机磷（Pi）含量的计算
将∆A测带入方程得到y值（mM）。
3. PC活性计算
（1）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U。
上清中PC活性的计算：
PC上清活性(U/g 鲜重)= (y上清×V酶促×106)÷(V样÷V提取×W)÷T=666.67×y上清÷W
沉淀中PC活性的计算:
PC沉淀活性(U/g 鲜重)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V样÷V重悬×W)÷T=666.67×y沉淀÷W
样本PC总活性的计算：
样本PC总活性即为上清中PC活性与沉淀中PC活性之和。
按样本鲜重计算：PC总活性（U/g 鲜重）=666.67×y上清÷W+ 666.67×y沉淀÷W
=666.67×（y上清+y沉淀）÷W
（2）按细胞数量计算
单位的定义：每1万个细胞每分钟产生1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位U。
上清中PC活性的计算：
PC上清活性(U/104 cell)= (y上清×V酶促×106)÷(V样÷V提取×500)÷T=1.33×y上清
沉淀中PC活性的计算:
PC沉淀活性(U/104 cell)=(y沉淀×V酶促×106)÷(V样÷V重悬×500)÷T=1.33×y沉淀
样本PC总活性的计算：
样本PC总活性即为上清中PC活性与沉淀中PC活性之和。
按细胞数量计算：PC总活性（U/104 cell）=1.33×y上清+1.33×y沉淀=1.33×（y上清+y沉淀）
（3）按样本蛋白浓度
单位的定义：每毫克组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U。
上清中PC活性的计算：
PC上清活性(U/mg prot)= (y上清×V酶促×106)÷Cpr×V样)÷T=666.67×y上清÷Cpr
沉淀中PC活性的计算:
PC沉淀活性(U/mg prot)=(y沉淀×V酶促×106)÷(Cpr×V样)÷T=666.67×y沉淀÷Cpr
样本PC总活性的计算：
样本PC总活性即为上清中PC活性与沉淀中PC活性之和。
按样本鲜重计算：PC总活性（U/g 鲜重）=666.67×y上清÷Cpr+ 666.67×y沉淀÷Cpr
=666.67×（y上清+y沉淀）÷Cpr
V酶促：酶促反应体系总体积，2×10-4L；106：单位换算系数，1mmol=106nmol；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，30min；V提取：提取体系体积，1mL ；W：样本重量，g；V重悬：重悬沉淀体积，1mL；500：细胞总数，500万；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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