产品简介
铁是人体必需的微量元素之一，对于维持机体正常生理功能具有重要作用。亚铁离子是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及其他酶系统的重要组成成分，帮助氧的运输，促进脂肪氧化。缺乏铁元素容易造成贫血、代谢紊乱，并影响机体的免疫功能。铁过量是引发或加剧多种慢性病,如：糖尿病、心血管疾病、神经退化性疾病的危险因素。本试剂盒提供了一种简单的方法来检测样本中亚铁离子浓度，其原理是Fe2+在酸性环境下与三吡啶三吖嗪形成蓝色的配合物Fe2+-TPTZ，在593nm处有特征吸收峰，通过测定593nm吸光度的变化可计算Fe2+ 的含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 60mL | 120mL | 4℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1mL | 2mL | -20℃避光保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测593nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机
浓硫酸、去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；分装-20℃保存。
工作液的配制：临用前配制，将试剂一、试剂二按 10:1的比例混合，现配现用。
标准品：含10mg FeSO4.7H2O，临用前加入900µL去离子水和20µL浓硫酸，配成40mmoL/L(40000µmol/L)标准品，4度可保存2周或分装-20度长期保存。
标准曲线设置：取10µL 40mmoL/L(40000µmol/L)标准品用990µL去离子水稀释至400µmol/L。取200µL 400µmol/L的标准品用600µL去离子水稀释至100µmol/L。用100µmol/L按下表所示，进行下一步稀释：
标准品体积 (µL) | 去离子水体积(μL) | 浓度 (µmol/L) | |
Std.1 | 800µL 100µmol/L | 0 | 100 |
Std.2 | 400µL of Std.1 | 400 | 50 |
Std.3 | 400µL of Std.2 | 400 | 25 |
Std.4 | 400µL of Std.3 | 400 | 12.5 |
Std.5 | 400µL of Std.4 | 400 | 6.25 |
Std.6 | 400µL of Std.5 | 400 | 3.13 |
Std.7 | 400µL of Std.6 | 400 | 1.56 |
注意：标准品现配现用；稀释后的标准溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备
动植物组织：称取0.1g样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，转移到1.5mL EP管中，10,000g，4℃离心10min，取上清液于新离心管中，置冰上检测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），转移到1.5mL EP管中，10,000g，4℃ 离心10min，取上清液于新离心管中，置冰上检测。
血清（浆）等液体样本：直接检测，若有浑浊离心后取上清。
注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。
2. 如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到593nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：
试剂名称 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） |
去离子水 | 100 | 0 | 0 | 200 |
标准品 | 0 | 100 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 100 | 100 |
工作液 | 200 | 200 | 200 | 0 |
充分混匀，37℃静置10min，于593nm测定吸光值，计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空。（空白孔只需做一次，设置对照是为了消除样本本身颜色的影响，如果是细胞等无明显颜色的样本无需设置对照，ΔA测=A测-A空）
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果A测大于0.8，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将样本的ΔA测代入方程得到浓度y值（1μmol/L=1nmol/mL）
2. 亚铁离子含量的计算
（1）按液体样本的体积计算
亚铁离子含量(µmol/L)=y
（2）按样本质量计算
亚铁离子含量(nmol/g)=y×V样本÷(V样本÷V样总×W)=y÷W
（3）按细胞数量计算
亚铁离子含量(nmol/104 Cells)=y×V样本÷(500×V样本÷V样总)=y÷500=0.002y
（4）按样本蛋白浓度计算
亚铁离子含量(nmol/mg prot)=y×V样本÷(V样本×Cpr)=y÷Cpr
V样本: 加入反应体系中上清液体积，0.1mL；V样总: 加入提取液体积，1mL；W: 样品质量，g；500: 细胞数量，5×106；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
结果展示
典型标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
