产品简介
NADPH 氧化酶(NAO)广泛存在于动物、植物和真菌中,是一个典型的膜蛋白,催化NADPH氧化生成NADP+,并将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。该酶异常可导致人慢性肉芽肿病(GCD),在植物中,该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本中NADPH 氧化酶(NAO)的活性水平。其原理是NADPH 氧化酶(NAO)将 NADPH氧化为NADP+,NADPH在340nm有特征吸收峰,而 NADP+没有;通过测定 340nm吸光度减少的速率来计算得出NAO酶活性大小。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
反应缓冲液 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;4℃保存。
反应缓冲液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:临用前配制;用前96T加入5mL去离子水,48T加入2.5mL去离子水,未用完试剂分装-20℃保存,实验时冰上放置,避免反复冻融。
样本制备
动植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL预冷的提取液,冰浴匀浆,12,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
细胞:收集5×106个细胞,用冷PBS清洗细胞后弃上清,加入1mL预冷的提取液冰浴超声波破碎5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次)。12,000g,4℃,离心10min,取上清,置冰上待测。
血清、血浆等液体样本:可直接测定,根据预实验确定稀释倍数。
注意:建议使用新鲜样本。如果不立即使用,可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm,可见分光光度计去离子水调零。
2.反应缓冲液置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)预热15min。
3.样本测定:在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10μL样本,150μL反应缓冲液和40μL试剂一。充分混匀,记录340nm处1min 20s时吸光值A1,迅速放入25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)恒温箱中,准确反应 5min。迅速取出记录6min 20s时的吸光度 A2。计算ΔA=A1-A2。
注意:1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可延长反应时间T(如至10min或更长),或适当加大样本量;注意对计算公式进行调整。如果ΔA大于1.0,可用提取液稀释样品,计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)。
3. 因通过反应速率计算酶活,使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本)。
结果计算
NAO活力单位的计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按样本鲜重计算
活力单位定义:一定条件下,每g样品在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
6PGDH(U/g 鲜重)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=1286×ΔA÷W
2. 按液体体积计算
活性单位定义:一定条件下,每mL液体样本在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。6PGDH(U/mL)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=1286×ΔA
3. 按细胞数量计算
活力单位定义:一定条件下,每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
6PGDH(U/104 Cells)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1286×△A÷500=2.572×△A
(4)按蛋白浓度计算
活力单位定义:一定条件下,每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
6PGDH(U/mg prot)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=1286×△A÷Cpr
ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4 L;109:1mol=1×109nmol;V样:加入反应体系中样本体积,10μL =0.01mL;V样总:提取液体积,1mL;Cpr:上清液蛋白浓度mg/mL;W:样品质量,g;T:反应时间,5min;500:细胞数量,500万。
B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d:0.5cm 调整为 d:1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。
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