产品简介
NADPH 氧化酶（NAO）广泛存在于动物、植物和真菌中，是一个典型的膜蛋白，催化NADPH氧化生成NADP+，并将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。该酶异常可导致人慢性肉芽肿病（GCD），在植物中，该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本中NADPH 氧化酶（NAO）的活性水平。其原理是NADPH 氧化酶（NAO）将 NADPH氧化为NADP+，NADPH在340nm有特征吸收峰，而 NADP+没有；通过测定 340nm吸光度减少的速率来计算得出NAO酶活性大小。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
反应缓冲液 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；4℃保存。
反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：临用前配制；用前96T加入5mL去离子水，48T加入2.5mL去离子水，未用完试剂分装-20℃保存，实验时冰上放置，避免反复冻融。
样本制备
动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL预冷的提取液，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞：收集5×106个细胞，用冷PBS清洗细胞后弃上清，加入1mL预冷的提取液冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。12,000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。
血清、血浆等液体样本：可直接测定，根据预实验确定稀释倍数。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1．酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，可见分光光度计去离子水调零。
2．反应缓冲液置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热15min。
3．样本测定：在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10μL样本，150μL反应缓冲液和40μL试剂一。充分混匀，记录340nm处1min 20s时吸光值A1，迅速放入25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）恒温箱中，准确反应 5min。迅速取出记录6min 20s时的吸光度 A2。计算ΔA=A1-A2。
注意：1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可延长反应时间T（如至10min或更长），或适当加大样本量；注意对计算公式进行调整。如果ΔA大于1.0，可用提取液稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
NAO活力单位的计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按样本鲜重计算
活力单位定义：一定条件下，每g样品在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
6PGDH（U/g 鲜重）=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=1286×ΔA÷W
2. 按液体体积计算
活性单位定义：一定条件下，每mL液体样本在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。6PGDH(U/mL)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=1286×ΔA
3. 按细胞数量计算
活力单位定义：一定条件下，每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
6PGDH(U/104 Cells)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1286×△A÷500=2.572×△A
（4）按蛋白浓度计算
活力单位定义：一定条件下，每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
6PGDH(U/mg prot)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=1286×△A÷Cpr
ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109nmol；V样：加入反应体系中样本体积，10μL =0.01mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白浓度mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，5min；500：细胞数量，500万。
B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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