产品简介
总氧化状态(TOS)是指生物体内所有抗氧化物质与氧化物质的动态平衡状态。TOS反映了生物体内氧化应激的水平，是评估氧化损伤和抗氧化能力的重要指标。本试剂盒提供了一种简单易用的方法，用于测量各种生物样本的TOS。原理是在酸性条件下，样本中的氧化性物质可将二价铁离子氧化为三价铁离子，后者与二甲酚橙结合产生一种蓝紫色的复合物，在580nm有最大吸收峰。通过测定580nm吸光度变化可以间接测定样本的总氧化状态。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃ |
显色物 | 2.5mL | 5mL | 4℃避光保存 |
H2O2标准品(1M) | 0.1mL | 0.1mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测 580nm处的吸光度）
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
10kDa的超滤管（用来去除蛋白）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；4℃保存。
显色物：即用型；使用前，平衡到室温；整个实验过程中，避光放置；4℃避光保存。
H2O2标准品(1M)：即用型；使用前，平衡到室温；整个实验过程中，避光放置；4℃避光保存。
标准曲线设置：
先配制2mM H2O2标准品：取2μL H2O2标准品(1M)加998μL 提取液稀释；
再配制200μM H2O2标准品：取50µL 2mM的H2O2标准品加入450μL提取液稀释。
使用200μM H2O2标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品。
标准品体积 | 提取液体积（µL） | 标准品浓度(μM) | |
Std.1 | 400µL of 200μM | 0 | 200 |
Std.2 | 200µL of Std.1 (200μM) | 200 | 100 |
Std.3 | 200µL of Std.2 (100μM) | 200 | 50 |
Std.4 | 200µL of Std.3 (50μM) | 200 | 25 |
Std.5 | 200µL of Std.4 (25μM) | 200 | 12.5 |
Std.6 | 200µL of Std.5 (12.5μM) | 200 | 6.25 |
Std.7 | 200µL of Std.6 (6.25μM) | 200 | 3.13 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4h之内使用；如果样本是细胞悬浮液，建议使用培养基配制H2O2标准品。
样本制备
动植物组织：称取 0.1g组织，加入1mL预冷的提取液，冰上匀浆。12,000g，4℃离心10min，取上清液待测。
细胞和细菌样本的制备：收集5×106个细胞或细菌，用冷PBS清洗细胞或细菌后弃上清，加入 1mL预冷的提取液冰上匀浆。12,000g，4℃离心10min，取上清液待测。
血清、血浆、尿液（和其它生物学液体）：直接测定。
为了消除蛋白可能造成的干扰，可以对处理好的样本进行去除蛋白的处理。
去除蛋白的方式：使用10kDa的超滤管过滤后取滤液。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。如下物质会干扰检测结果，样本中应避免存在：Ferric salts, iron salts, sucrose, glucose, ascorbic acid, SDS (>0.2%), sodium azide。
实验步骤
1．酶标仪或可见分光光度计预热30min 以上，调节波长到580nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2．在 96 孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：
试剂（µL） | 空白孔 | 标准孔 | 测定孔 |
提取液 | 60 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 60 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 60 |
显色物 | 40 | 40 | 40 |
3. 充分混匀，37℃孵育10min，读取580nm处的吸光值，记为 A空、A标、A测，计算ΔA标=A标-A空、ΔA测=A测-A空（空白孔只需测定1次）。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于0.5，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制 以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测代入公式计算出y(1µM=1nmol/mL)。
2. 样本TOS计算
（1）按样本鲜重计算 TOS(nmol H2O2/g 鲜重)=y×V样÷(W×V样÷V样总)×n=y÷W×n
（2）按样本体积计算 TOS(nmol H2O2/mL)=y×V样÷V样×n=y×n
（3）按细胞或细菌数量计算 TOS(nmol H2O2/104 Cell)=y×V样÷(细胞或细菌数量×V样÷V样总)×n=y÷500×n
V样：加入样本体积，0.06mL；W：样本质量，0.1g；V样总：样本制备时加入提取液体积，1mL；n：样本稀释倍数；500：细胞或细菌数量，500万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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