检测范围：62.5-4000pg/mL   灵敏度：37.5 pg/mL 

精密度：板内变异系数<10%，板间变异系数<10%

回收率：范围从 83%到 99%，平均回收率 95%

特异性：检测具有高灵敏度和优良的特异性。未观察到和人单核细胞趋化蛋白1(MCP-1/CCL2)类似物之间的显着交叉反应或干扰。

适用样本：血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清和其他生物体液

检测原理

该试剂盒采用双抗夹心酶联免疫吸附法原理。酶标板预包被亲和纯化的抗人MCP-1的抗体。将含有人MCP-1 的样品或标准品加入到酶标板中，与包被抗体反应。再加入生物素标记的检测抗体，并与酶标板上捕获的人MCP-1结合。接着，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）以形成固相抗体-人MCP-1-生物素标记抗体-SA-HRP的夹心复合物。然后，将TMB溶液加入孔中并进行孵育，酶促反应产生蓝色物质，加入终止液后，变成黄色。在450nm 波长下测定吸光值。最后通过建立标准曲线，根据OD值来计算样品中人MCP-1的浓度。

试剂盒组成及保存

未拆封的试剂盒可在 2-8 ℃保存 6 个月；如果开封使用后，请按照下表中的条件分别保存各组分。

自备耗材

酶标仪（能测450nm处的吸光度）

多通道移液器或自动洗板机

恒温箱、低温离心机

可调节式移液枪及枪头

去离子水

试剂准备

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

1.使用前将所有试剂平衡至室温(18-25℃)。按照酶标仪说明书进行设置检测波长为450nm，并在读板前预热 15 分钟。

2.洗涤液:取浓缩洗涤液，根据检测数量，用去离子水或蒸馏水1：24稀释，混匀后备用（浓缩洗涤液如有结晶可40℃水浴溶解后再使用）。

3.检测试剂A工作液：实验前计算所需量(100μL/孔)。在准备工作中，应该准备比计算量稍微多一点（多 100-200μL）。使用前15分钟，将原液管离心，用检测试剂 A 稀释液将 100×浓缩检测试剂 A 稀释至 1×工作液（如：10μL 检测试剂 A + 990μL 检测试剂 A 稀释液）。

4.检测试剂B工作液：实验前计算所需量(100μL/孔)。在准备工作中，应该准备比计算量稍微多一点（多 100-200μL）。使用前15分钟，将原液管离心，用检测试剂 B 稀释液将 100×浓缩检测试剂 B 稀释至 1×工作液（如：10μL 检测试剂 B + 990μL 检测试剂 B 稀释液）。

5.标准工作液：首先，标准品1000×g 离心1min，加入1mL标准品/样品稀释液，使其静止10min 再轻柔混匀，这就是4000pg/mL工作储备液,然后取7个 EP 管，每管内加入500μL标准品/样品稀释液。吸取 500μL 4000pg/mL 标准品稀释液到第一个管内再混匀即为2000pg/mL 工作液。按照下表将500μL的溶液从前管移到后管中。在下一次转移前，将每管彻底混匀。设定7个梯度稀释标准品如 4000pg/mL,2000pg/mL,1000pg/mL,500pg/mL,250pg/mL,125pg/mL,62.5pg/mL, 最后1个装有标准品/样品稀释液的 EP 管是空白对照作为 0pg/mL。

注意：每次实验，请使用新配制的标准品，工作储备液可2-8℃保存一周。

样品收集

血清：让血样在室温下凝结 2 小时或在 2-8℃下过夜，然后在 2-8℃下 2000× g 离心 15 分钟。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃备用。

血浆：使用 EDTA 或肝素作为抗凝剂收集血浆。采集后 30 分钟内，在 2-8℃,2000×g 条件下离心样品 15 分钟，随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

组织匀浆：应在预冷的 PBS 中冲洗组织，彻底清除多余的血液，称重，切成小块。然后在冰上的采用玻璃匀质器在 PBS（组织重量（g）：PBS（mL）体积=1：9）中均质化组织块。使用超声波细胞破碎机对所得匀质悬浮液进行超声处理，直到溶液澄清。然后将匀浆在 10000×g 下离心 5 分钟。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

细胞裂解物：对于粘附细胞，用适量预冷的 PBS 轻轻清洗细胞，并用胰蛋白酶分离细胞。以 1000×g 离心 5 分钟收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集）。弃上清，用冷 PBS 清洗细胞 3 次。以浓度为5×10⁶ 个细胞/1mL 预冷 PBS 重新悬浮细胞。重复冻融数次，直到细胞完全溶解。1500×g，2-8℃离心 10min。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

细胞培养上清和其他生物体液：在 1500×g，2-8℃条件下离心样品15分钟。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

注意：不要使用严重溶血或脂血的标本。如果样品要在6天内使用，则可以将其储存在2-8℃，长期保存需分装存储在-20℃或-80℃，避免反复冻融。测定前，应将冷冻样品缓慢升至室温并轻轻混合。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本用标准品/样品稀释液稀释几个不同倍数做预实验确定合适的稀释倍数，计算结果乘以稀释倍数。

实验步骤

1.从板框上取下待用的微孔板条，将剩余的板条放回装有干燥剂的铝箔袋中，然后重新密封保存。

2.将标准工作溶液加入前两列，每个浓度设置一个复孔(每孔100μL)。其余孔加入100μL待测样本(建议通过预实验确定待检样本的稀释倍数)。盖上试剂盒提供的封板膜。37℃孵育90分钟。

3.手工洗板：弃去每孔中的液体，每孔加入350μL洗涤液。浸泡30秒再倒出每孔中液体并在干净的吸水纸上拍干。重复这个洗涤步骤，共3遍。洗板机洗板：选择洗涤3次程序洗板后拍干。

4.向每孔中加入100μL 的检测试剂A工作液。盖上封板膜。37℃孵育60 分钟。

5.弃去每孔中的液体，重复步骤3的洗涤过程3遍。

6.向每孔中加入100μL的检测试剂 B工作液。盖上封板膜。37℃孵育30分钟。

7.弃去每孔中的液体，重复步骤3的洗涤过程5遍。

8.每孔加底物溶液(TMB)100μL。盖上新的封板膜。37℃避光孵育 10-20 分钟（当标品浓度梯度后三孔有明显蓝色梯度，前三孔的梯度不明显时即可终止）。

9.每孔加入 50μL 的终止液，顺序与加入底物溶液(TMB)的顺序一致，轻轻晃动混匀。

10.确保酶标板孔底无气泡水雾等，立即在450nm 测量每孔的吸光度 OD 值。

计算

每个标准品和样品的重复读数分别取平均值，然后减去零孔 OD 的平均值。以x 轴为 OD 值，y 轴为标准品浓度。拟合一条标准曲线，将样本减去零孔后的OD值作为x带入计算y（浓度） 。如果样品被稀释，从标准曲线上读出的浓度必须乘以稀释系数。

结果展示

典型标准曲线（R²≥0.99）

人单核细胞趋化蛋白1(MCP-1/CCL2)标准曲线。数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线

注意事项

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。终止液有一定的腐蚀性，操作时请做好防护措施。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。

3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。收到试剂盒后，未开封的试剂盒可在2-8℃下保存1个月。如果试剂盒在1个月内不使用，请在收到试剂盒后，将每个组件分别存放在上表中指示的温度下。

4. 新打开的ELISA酶标板可能含有水雾样物质，此为正常现象，不会对实验结果产生任何影响。未用完的板条应立即放回装有干燥剂的铝箔袋中，重新密封并在-20℃下存储。

5. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。

6. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。

7. 溶解含有蛋白质溶液时，应始终避免起泡。

8. 不得重复使用稀释后的工作液。

9. 为了得到准确的实验结果，在孵育过程中，必须确保封板膜将酶标板密封。

10. 在使用自动洗板机时，添加清洗缓冲液后，在清洗步骤之间添加30秒的浸泡时间可提高分析精度。

11. 底物溶液保存过程中应为无色，加入到酶标板中之后底物溶液应从无色变为渐变蓝色。

12. 终止液应按照与加底物溶液(TMB)相同的顺序添加到酶标板中。添加终止液后，孔中溶液的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表明终止液未与底物溶液充分混合，应轻拍孔板使其混匀。

疑难解答

PMK1358.人脂蛋白α(Lp-α)ELISA试剂盒

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