脂滴是由磷脂单分子层及甘油三酯(Triglyceride)、胆固醇酯(Cholesteryl ester,CE)组成的中性脂肪(Neutral lipid)疏水核心构成,广泛存在于动物、细菌、酵母、植物和昆虫细胞中。脂滴能够沿着细胞骨架运动,并与其它细胞器相互作用,在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解、以及信号传导过程中起着重要的作用。多种代谢性疾病,如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病、中性脂贮存性疾病和Niemann Pick C疾病等,可能都伴随着脂质贮存的异常。本试剂盒英文名为Lipid Droplets Red Fluorescence Assay Kit with Nile Red,也称 Nile Red Staining Kit或Red Neutral Lipid Stain,是一种基于荧光探针尼罗红(Nile Red)来检测细胞内脂滴(Lipid droplets) 的试剂盒。本试剂盒所使用的荧光探针为尼罗红(Nile Red),其在磷脂 (phospho-lipid)中大激发光波长约为552nm,大发射光波长约为636nm,此时为红色荧光;也可以把激发波长设置为450-500nm,发射波长设置为大于528nm,此时为绿色荧光;但红色荧光通常比绿色荧光明亮很多。由于Nile Red在红色荧光时也可以染细胞膜,而在绿色荧光时只染脂滴,所以如果特别关注脂滴的特异性时,也可以设置参数为Ex/Em=485/535nm进行检测。Nile Red在水和其它极性溶剂中几乎无任何荧光,一旦与甘油三酯等中性脂肪结合,便发出明亮的红色荧光(由于其发射光谱范围广,也可以设置参数观察到绿色荧光)。本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测系统。
荧光显微镜或流式细胞仪或荧光酶标仪、离心机
细胞培养板、可调节式移液枪及枪头
PBS
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多个修饰位点,本身可以呈现多条带,建议查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小;
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作;
3、杂蛋白多,建议处理目的蛋白;
4、抗体特异性不强,建议使用特异性强的抗体;
5、抗体孵育时间过久,建议减少抗体孵育时间;
6、二抗与抗原有交叉反应,建议选择合适的封闭物;
7、二聚体或多聚体存在,建议增加蛋白质变性过程及强度;
8、底物显色与曝光时间过长,建议缩短显色及曝光的时间。
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