CCK-8是一种高灵敏度、无放射性的比色检测法，用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数量，可替代传统的MTT法，常应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。实际操作中有许多细节需要注意，本期内容主要是介绍CCK-8法的原理、步骤及注意事项。
CCK-8试剂盒是基于高度水溶性的四唑盐 WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H- 四唑单钠盐)而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子介体的作用下可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成水溶性橙黄色甲瓒产物（formazan），产生颜色反应。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目成正比。增强型CCK-8试剂盒检测灵敏度高于其他四唑盐（例如 MTT，XTT，MTS 或 WST-1）。
实验操作流程
① 96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔；留2个空白孔不加细胞，加入同体积的培养基），将板在潮湿的培养箱中预先培养24h（37°C，5% CO2）。
②在平板的每个孔中加入 10μL CCK-8溶液，注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰 OD值读取（步骤1中加了细胞的，留2个对照组不加药物，加入同体积的培养基）。
③在培养箱中将平板孵育 1-4h；时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定；
④使用酶标仪测量450nm 处的吸光度。
⑤如果暂时不测定OD值，可向每孔中加入10μL 0.1 MHCL溶液或者1%（W/V）SDS溶液，并遮盖培养板避光室温保存。在24 h内吸光度不会发生明显变化。
细胞种板浓度：通过查看文献确认。查看实验所用细胞别人是否使用过，找出大致范围。稀释一系列浓度种板。 贴壁生长的时间一般设置贴壁24 h，这个时间一般细胞已经贴壁完全，且对安排实验时间也方便。
加药后的孵育时间：设置时间梯度，根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择好的时间。 接种时注意细胞悬液一定要混匀，避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种数孔即混匀一下。培养板周围一圈孔内的培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基或无菌PBS，而不作为指标检测孔。 CCK-8试剂加入量：按照说明书加入合适的含量。若细胞体系较大，适当增加CCK-8的量。 CCK-8试剂加入后，随着孵育时间的增加，OD值就会增大。CCK-8的佳反应时间以显色的佳时间为准。次做实验时，建议先做数孔摸索接种细胞的佳数量和加入CCK-8试剂后的佳孵育时间。一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的CCK-8反应时间或增加细胞数量（约105个细胞/孔）。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞，在加入CCK-8孵育1~4 h后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定决定CCK-8佳孵育时间。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再测定。对于贴壁细胞，CCK-8的孵育时间一般为1~4 h，多数细胞在培养30 min左右即可肉眼观察到明显的显色反应，培养3.5~4 h左右检测效果佳。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。 实验时尽量多设置复孔，取平均值。实验时把OD值控制在1.0左右。因人为造成的数据不稳定只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。另外实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。 CCK-8的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。含有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。 如何判定待测溶液是否有还原性？不含细胞的待测溶液孔中加入CCK-8溶液10 μL，孵育1~4 h，测定在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，说明待检测体系中存在较少的还原剂，正式检测时即可直接加入CCK-8；如果该吸光度相对较大，说明待检测体系中存在较多的还原剂，正式检测时则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基和10 μL CCK-8进行检测。 如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议设定600 nm（或600 nm以上）作为参比波长，扣除参比波长的OD值即可。
