答：可能的原因有：

1、膜没有完全均匀湿透,建议 使用100% methanol浸透膜；

2、洗膜不充分，可以增加洗液体积和洗涤次数；

3、电极不平衡或者加样位置偏斜，可以调整电极和加样；

4、封闭物用量不足，可以提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜；

5、封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；

6、封闭时间不够，一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜；

7、抗体非特异性结合，可以降低抗体浓度，减少孵育时间；

8、一抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择适宜的抗体稀释度；

9、一抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜；

10、抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间；

11、化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物。

答：可能的原因有：

1、胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度；

2、抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间；

3、酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物；

4、目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定；

5、标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量。

答：可能的原因有：

1、目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小；

2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作；

3、杂蛋白多，建议处理目的蛋白；

4、抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体；

5、抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间；

6、二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物；

7、二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度；

8、底物显色与曝光时间过长，建议缩短显色及曝光的时间。

答：如果能够排除下面的几个问题，那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

1、二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；

2、ECL底物中H2O2不稳定，失活；

3、ECL底物没覆盖到相应位置；

4、一抗选择不当；

5、二抗失活。