传说中的一步法ELISA有何玄机？
在前面的《啥是ELISA？》一文中，我们给大家简单介绍了ELISA的四种主要类型。今天我们再讲解一个经常听到的概念-一步法ELISA。
我们知道ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
ELISA中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。
今天要说的一步法ELISA其实是双抗体夹心法在常规的基础上进行变化的一个变种。介绍一步法ELISA以前我们还是先说说下夹心法。
夹心法简介
夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法：
双抗原夹心法
双抗原夹心法中抗原被包被于固相，检测样本中的抗体结合于抗原后，使用酶标的抗原进行结合及后续反应，可以用来测定样本中的抗体。双抗原夹心法的关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构进行设计，在医学检验上测定抗HBsAg抗体采用的就是此法，检测时被测样本不需要稀释即可直接进行测定，故此灵敏度相对而言高于我们随后要说的间接法。
双抗原夹心法（图片来源：网络）
双抗体夹心法
双抗体夹心法中抗原的2个不同的抗原表位被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，分别结合。捕捉抗体固定于载体即酶标板上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的捕捉抗体通常是单抗，偶尔有用多抗做为捕捉抗体的情况，但很少见，因为以多抗作为捕捉抗体容易出现交叉反应而降低特异性。检测抗体通常为多抗。根据具体的实验步骤又分为几个基本的类型：
传统的HRP酶标记抗体的双抗体夹心法
常规的双抗体夹心法是，针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，其中酶标抗体通常为HRP酶标记的检测抗体。适用于测定大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
带有生物素－亲和素放大系统的双抗体夹心法
生物素－亲和素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。近年大量研究证实，生物素—亲和素系统几乎可与研究成功的各种标记物结合。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。在商业化的科研试剂盒中经常用到生物素标记的山羊多抗，再让生物素标记的多抗与HRP标记的亲和素或者链霉亲和素结合，然后再加HRP也就是辣根过氧化物酶的底物，通常是TMB反应显色，这种方法是在传统的HRP酶标记抗体的双抗体夹心法ELISA中引入了生物素-亲和素放大系统。不过也有用单抗做检测抗体的情况，尤其是在科研中。
双抗体夹心法（图片来源：网络）
啥是双抗体夹心一步法ELISA？
双抗体夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相关的，以及在科研中检测细胞因子等。由于双抗体夹心法特异性高，为了节省时间，在传统的HRP酶标记抗体的双抗体夹心法检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应，就称为双抗体夹心一步法。这样整个实验过程中只需要一次孵育和一个洗板步骤快仅需一小时，因为操作时间短，在商业化生产中有很大优势。
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